腓骨肌萎缩症PMP22、CX32、MFN2基因突变检测及CX32功能研究

发布时间：2022-07-13 20:03

　　背景及目的：腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth disease, CMT）,又称遗传性运动感觉性神经病（Hereditary motorsensory neuropathy, HMSN）,是一组最常见周围性基因遗传病。CMT1型约占CMT总数的50%,其中以PMP22基因大片段串联重复突变所致CMT1A最常见,占CMT1型的70%。CMT2型主要遗传方式为常染色体显性遗传,占CMT的20%-40%左右,其中最常见类型为MFN2基因突变导致的CMT2A型,约占CMT2型的8%-33.3%。CMTX型在所有CMT型患者中所占比例约为10%～15%,CMTX中最常见的为显性遗传CMTX,即CMTX1型,由CX32基因突变导致,占了CMTX型中近90%。至今CMT己50个位点及30多个基因被定位,研究发现CMT并不具有很好的基因-表型相关性,即使是同一家系内同一基因突变导致的不同患者临床表现均不完全一致。在CMT疾病诊断方面,系统、方便有效的基因诊断流程的建立非常必要。本课题针对CMT最常见致病基因PMP22、CX32、MFN2展开突变筛查工作,同时构建CX32（c.65G&... 

【文章页数】：72 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
资助基金
目录
第一章 前言
第二章 材料与方法
    2.1 主要实验仪器、试剂与耗材
        2.1.1 主要实验仪器
        2.1.2 主要的试剂与耗材
        2.1.3 主要溶液的配置
    2.2 CMT1A致病PMP22基因重复特异REP连接片段的PCR-双酶切
        2.2.1 研究对象
        2.2.2 gDNA抽提及定量
        2.2.3 PMP22等位基因特异PCR双酶切
        2.2.4 PCR反应体系及扩增条件
        2.2.5 PCR扩增产物电泳验证
        2.2.6 双酶切验证
    2.3 CMTX1致病CX32基因PCR-直接测序
        2.3.1 研究对象及gDNA抽提及定量
        2.3.2 CX32目的基因片段扩增
    2.4 CMT2A致病MFN2基因PCR-直接测序
        2.4.1 研究对象及gDNA抽提及定量
        2.4.2 MFN2目的基因片段扩增
A)位点突变致CMT的表达研究分析">    2.5 CX32基因65(G>A)位点突变致CMT的表达研究分析
        2.5.1 PCR扩增目的片段
        2.5.2 目的片段验证及PCR产物纯化
        2.5.3 纯化产物加A尾(A-tailing)
        2.5.4 低熔点琼脂糖凝胶跑胶回收产物
        2.5.5 PCR产物与pGEM-T载体的链接反应
        2.5.6 T链接产物的转化
        2.5.7 挑选克隆摇菌
        2.5.8 菌液PCR鉴定+保菌
        2.5.9 抽提质粒
        2.5.10 鉴定克隆
        2.5.11 pGEM-T载体酶切目的片段链接至pEGFP-N1质粒
        2.5.12 pEGFP-N1质粒转化、挑克隆、摇菌、保菌、抽质粒、质粒鉴定(步骤大致同前)
        2.5.13 pEGFP-N1-mtCX32(F-R-15815)、pEGFP-N1-wtCX32(F-R-582)转染入Hela人宫颈癌传代细胞
        2.5.14 细胞制片
第三章结果
    3.1 CMT1A致病PMP22基因重复特异REP连接
        3.1.1 PMP22基因重复特异REP连接片段的PCR产物
    3.2 CMTX1致病CX32基因PCR-直接测序结果
    3.3 CMT2A2致病MFN2基因PCR-直接测序结果
A)质粒构建、转化、转染实验结果">    3.4 CX32(c.65G>A)质粒构建、转化、转染实验结果
A">        3.4.1 PCR产物直接测序进行验证,突变型c.65G>A
        3.4.2 转化
        3.4.3 成功构建pEGFP-N1-wtCX32及pEGFP-N1-mtCX32质粒测序验证对照
A)转染Hela细胞">        3.4.4 CX32(c.65G>A)转染Hela细胞
第四章 讨论
    4.1 CMT常见致病基因PMP22、CX32、MFN2基因突变检测结果分析
    4.2 CX32功能表达研究
第五章 结论
参考文献
附录 PMP22基因多种检测方法研究进展
    参考文献
致谢
已发表论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]突变缝隙连接蛋白32在X连锁Charcot-Marie-Tooth病1型患者的外周血管内皮细胞异常表达[J]. 栾兴华,洪道俊,乔晓会,吕鹤,王朝霞,袁云.  中华神经科杂志. 2011 (10)
[2]间隙连接基因Cx32在肝细胞癌中的表达意义[J]. 王赛,霍继荣,王海琴,施小六,刘德良.  中国医药导报. 2011(20)
[3]LITAF、RAB7、LMNA和MTMR2基因在中国人腓骨肌萎缩症患者的突变分析[J]. 张如旭,郭鹏,任志军,赵国华,刘三妹,刘婷,资晓宏,胡正茂,夏昆,唐北沙.  遗传. 2010(08)
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[7]中国人腓骨肌萎缩症小热休克蛋白27基因突变分析[J]. 刘小民,唐北沙,赵国华,夏昆,张付峰,潘乾,蔡芳,胡正茂,张成,陈彪,沈璐,张如旭,江泓.  中华医学遗传学杂志. 2005(05)
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[9]缝隙连接蛋白32（CX32）在癫痫发病中的作用[J]. 蔡正旭,张淑琴,郭慧淑,刘群,杨立彬,梁建民,王宇虹.  中风与神经疾病杂志. 2005(04)
[10]远端型遗传性运动神经病的小分子热休克蛋白22、27基因突变分析[J]. 张付峰,唐北沙,赵国华,夏昆,刘小民,严新翔,郭鹏,潘乾,蔡芳,张如旭.  中华神经科杂志. 2005(07)

硕士论文
[1]PMP22基因重复突变检测及CMT1A相关临床研究[D]. 段晓慧.中国协和医科大学 2009



本文编号：3660681