神经母细胞瘤中RHOB的作用及Perifosine处理后泛素化蛋白质组学的研究

发布时间：2022-08-13 16:44

　　目的:神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）是婴儿期最常见的恶性实体肿瘤,目前化疗耐药是高危组神经母细胞瘤患者的治疗难点。研究发现Akt抑制剂Perifosine在体内、外实验中均能诱导神经母细胞瘤细胞死亡,并能提高神经母细胞瘤细胞对化疗药物的敏感性,且在治疗复发难治性神经母细胞瘤的临床试验中呈现良好的效果。近年来,多项研究报道Perifosine除抑制Akt活性外,还能够通过其他作用机制引起细胞死亡。为了深入探索Perifosine新的作用机制,课题组前期在一个神经母细胞瘤细胞系SK-N-AS（AS）细胞中进行的全蛋白质组学分析发现Perifosine处理后RHO相关GTP结合蛋白B（Rho-related GTP-binding protein B,RHOB）表达水平升高。RHOB属于RHO亚家族,广泛分布于细胞内,调节细胞骨架、细胞黏附和细胞凋亡等。而RHOB在神经母细胞瘤中的作用尚无报道。本研究第一部分旨在探索RHOB在神经母细胞瘤中对Perifosine及化疗药物作用的影响。泛素化修饰是一种重要的蛋白翻译后修饰,泛素化蛋白质组学是研究蛋白质调控的重要方法,在前期总蛋... 

【文章页数】：123 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分：神经母细胞瘤中RHOB不同表达水平对Perifosine或化疗药物作用的影响
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 细胞培养
            2.2.2 siRNA及质粒转染
            2.2.3 药物处理
            2.2.4 RT-PCR检测mRNA水平
            2.2.5 Westernblot检测蛋白水平
            2.2.6 Incucyte变焦活细胞成像系统
            2.2.7 MTS检测细胞增殖
            2.2.8 流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡
            2.2.9 动物实验
            2.2.10 免疫组织化学染色
            2.2.11 统计分析
    3 结果
        3.1 Perifosine处理后神经母细胞瘤细胞及肿瘤组织中RHOB的表达水平升高
        3.2 RHOB不同表达水平与神经母细胞瘤患者临床病理相关性分析
            3.2.1 RHOB在神经母细胞起源但分化程度不同的肿瘤中表达水平的比较
            3.2.2 RHOB基因表达水平与神经母细胞瘤患者临床分期相关性分析
            3.2.3 RHOB基因表达水平与神经母细胞瘤患者肿瘤组织中MycN基因状态的关系
            3.2.4 RHOB基因表达水平与神经母细胞瘤患者临床预后的关系
            3.2.5 在节细胞神经瘤和神经母细胞瘤组织标本中,RHOB蛋白表达水平的比较
        3.3 RHOB不同表达水平对AS细胞增殖及存活的影响
            3.3.1 沉默RHOB对AS细胞增殖的影响
            3.3.2 过表达RHOB对AS细胞增殖及存活的影响
        3.4 RHOB不同表达水平对Perifosine作用的影响
            3.4.1 在AS细胞中,沉默RHOB对Perifosine作用的影响
            3.4.2 在AS细胞中,过表达RHOB对Perifosine作用的影响
        3.5 RHOB不同表达水平对AS细胞化疗敏感性的影响
            3.5.1 RHOB不同表达水平对AS细胞化疗敏感性的影响-依托泊苷(Etoposide)
            3.5.2 RHOB不同表达水平对AS细胞化疗敏感性的影响-长春新碱(VCR)
            3.5.3 RHOB不同表达水平对AS细胞化疗敏感性的影响-阿霉素(ADR)
            3.5.4 RHOB不同表达水平对AS细胞化疗敏感性的影响..顺铂(Cisplatin)
    4 讨论
    5 结论
    参考文献
第二部分：Perifosine治疗神经母细胞瘤的泛素化蛋白质组学研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 细胞培养
            2.2.2 SILAC标记
            2.2.3 蛋白提取
            2.2.4 酶解消化
            2.2.5 HPLC分馏
            2.2.6 亲和富集
            2.2.7 液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)
            2.2.8 数据分析
            2.2.9 生物信息学分析
            2.2.10 免疫共沉淀
            2.2.11 统计分析
    3 结果
        3.1 Perifosine处理AS细胞后泛素化蛋白质组学的定量分析
        3.2 Perifosine处理AS细胞后泛素化蛋白的Motif分析
        3.3 Perifosine处理AS细胞后差异表达的泛素化蛋白分析
            3.3.1 亚细胞结构定位分析
            3.3.2 GO(基因本体)分析
            3.3.3 富集分析
            3.3.4 基于富集分析的聚类分析
        3.4 Perifosine处理AS细胞后HMGCR泛素化水平升高
    4 讨论
    5 结论
    参考文献
本研究创新性的自我评价
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]Akt Inhibitor Perifosine Prevents Epileptogenesis in a Rat Model of Temporal Lobe Epilepsy[J]. Feng Zhu,Jiejing Kai,Linglin Chen,Meiling Wu,Jingyin Dong,Qingmei Wang,Ling-Hui Zeng.  Neuroscience Bulletin. 2018(02)
[2]Role of E3 ubiquitin ligases in lung cancer[J]. Barbara C Snoek,Leonie HAM de Wilt,Gerrit Jansen,Godefridus J Peters.  World Journal of Clinical Oncology. 2013(03)



本文编号：3677389