缺氧诱导因子1α与着丝粒蛋白W在人胶质瘤组织及细胞中表达的相关性

发布时间：2017-05-17 23:00

  本文关键词：缺氧诱导因子1α与着丝粒蛋白W在人胶质瘤组织及细胞中表达的相关性，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：神经胶质瘤起源于神经胶质细胞[1,2],是中枢神经系统中最常见、难治的原发性恶性肿瘤[3],大约占颅内肿瘤的一半[4]。既往有相关调查表明,神经胶质瘤的发生、发展和侵袭等过程都是多阶段的、多种基因参与的结果[5],但是其中的具体机制至今尚不明了[5]。着丝粒蛋白W(centromere protein W,CENP-W)又称肿瘤上调蛋白2(cancer-up-regulated gene 2,CUG2)基因,是2007年发现的一种致癌基因[7]。研究发现,CENP-W在卵巢、肝脏、肺、胰腺和结肠等恶性肿瘤组织中普遍存在高表达[8,9]。它的过表达既可以促进细胞的增殖,另一方面又可以诱导细胞的凋亡[10],具有很复杂的作用机制[11]。实验证明,CENP-W的过表达可诱发肿瘤形成[12],与人体各种恶性肿瘤的发生、发展和迁徙等过程有重要关系。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是缺氧环境诱导下细胞产生的一种核转录因子[13,14],可调控多种靶基因的表达[15],它在一般环境中很容易分解[16]。然而,目前CENP-W与HIF-1α在神经胶质瘤中的表达相关性尚未见相关报道。目的:本研究以Ⅰ~Ⅳ级神经胶质瘤组织、瘤旁脑组织和U251胶质细胞为实验对象,检测HIF-1α与CENP-W在神经胶质瘤组织及细胞中的表达及其相关性,探讨它们与胶质瘤生物学行为的关系,以期为胶质瘤的防治提供一些依据。方法:第一部分应用免疫组织化学染色方法检测41例含不同级别的胶质瘤组织标本、3例瘤旁脑组织标本中HIF-1α和CENP-W的表达水平,并统计学分析蛋白表达水平与胶质瘤临床病理特征的关系,以及两蛋白表达之间的相关性。第二部分应用不同浓度氯化钴[17]抑制胶质瘤U251细胞中HIF-1α的分解,细胞培养48 h后采用实时荧光定量PCR法检测CENP-W mRNA表达的变化,24h后采用蛋白质印迹法检测细胞中C ENP-W蛋白的表达的变化,统计学分析结果,探索当HIF-1α含量升高时对U251细胞中CENP-W蛋白及mRNA表达的影响。第三部分应用特异性小干扰rna(smallinterferencerna,sirna)干扰u251细胞中hif-1α表达使其下调后,采用蛋白质印迹法和实时荧光定量pcr法分别检测cenp-w蛋白及mrna表达的变化。应用特异性sirna干扰u251细胞中cenp-w表达使其下调后,采用蛋白质印迹法和实时荧光定量pcr法检测hif-1α蛋白及mrna表达的变化,并用统计学方法分析结果,进一步探索u251细胞中hif-1α和cenp-w表达的相关性。结果:1.免疫组织化学检测结果提示cenp-w主要表达于细胞核,有明显的异质性,在瘤旁正常组织、低级别(Ⅰ~Ⅱ)和高级别(Ⅲ~Ⅳ)胶质瘤标本中其表达阳性率分别是67%(2/3)、82%(14/17)和92%(22/24),统计学分析显示各组cenp-w表达率之间没有明显差异(χ2=1.794,p=0.408);但比较免疫组织化学评分发现,高级别组评分(3.58±1.06)普遍比低级别组(2.88±1.50)高,其中瘤旁组评分(2.00±2.00)最低。hif-1α主要表达于细胞核,高级别胶质瘤中有少量表达于细胞质,有明显的异质性;在瘤旁正常组织、低级别和高级别胶质瘤标本中其表达阳性率分别是0%(0/3)、47%(8/17)和79%(19/24),各组表达阳性率之间差异有统计学意义(χ2=9.440,p=0.009)。另外,cenp-w和hif-1α在胶质瘤中的表达与患者性别、年龄及胶质瘤病理类型均没有明显的关系。2.氯化钴模拟缺氧实验结果显示,当50μmol/l氯化钴处理胶质瘤u251细胞24~48h后,细胞生长状况和未经氯化钴处理的细胞相比无明显不同,显微镜下可见处理组细胞生长良好,同条件下细胞密度较高,细胞形态无明显异常。实时荧光定量pcr结果显示,50μmol/l氯化钴处理u251细胞24h后,hif-1αmrna表达水平无明显变化(t=1.965,p=0.08),cenp-wmrna表达水平升高(t=18.263,p0.01)。蛋白质印迹法检测结果显示,50μmol/l氯化钴处理u251细胞48h后,hif-1α蛋白的表达水平明显升高(t=10.271,p0.01),cenp-w蛋白表达水平也明显升高(t=7.813,p0.01)。3.hif-1asirna转染u251细胞36h后,实时荧光定量pcr结果显示,转染hif-1αsirna组hif-1αmrna表达水平较转染阴性对照组(q=10.01,p0.01)和未转染对照组(q=9.64,p0.01)明显降低,cenp-wmrna表达水平也较明显下降(q=9.95,p0.01;q=10.52,p0.01),2个对照组之间差异无统计学意义(P0.05)。转染48 h后,转染HIF-1αsiRNA组HIF-1α蛋白表达水平较2个对照细胞组明显降低(q=6.95,P0.01;q=7.59,P0.01),CENP-W蛋白表达水平也相应下降(q=5.01,P0.05;q=5.82,P0.01),2个对照组之间差异亦无统计学意义(P0.05)。4.CENP-W siRNA转染U251细胞36 h后,实时荧光定量PCR结果显示,转染CENP-W siRNA组CENP-W mRNA表达水平较转染阴性对照组(q=9.43,P0.01)和未转染对照组(q=8.95,P0.01)明显降低;然而,HIF-1αmRNA表达水平在3组之间无明显变化(P0.05)。转染48 h后,转染CENP-W siRNA组CENP-W蛋白表达水平较2个对照组明显降低(q=5.74,P0.01,q=5.39,P0.05),而HIF-1α蛋白表达水平无明显变化(q=2.95,q=2.64,P0.05)。结论:1.以瘤旁脑组织做为对照,HIF-1α和CENP-W在胶质瘤标本均存在高表达,与肿瘤级别呈正相关,且HIF-1α和CENP-W在胶质瘤标本中的表达呈一定的相关性,提示HIF-1α和CENP-W可能共同参与了胶质瘤的发生与发展。2.应用氯化钴模拟缺氧实验,成功证明当U251细胞中HIF-1α适量积聚时,细胞中CENP-W的表达也升高,表明HIF-1α可能调节U251细胞CENP-W的表达。3.HIF-1αsiRNA转染U251细胞后CENP-W的表达也随之降低,进一步表明HIF-1α可能调节U251细胞CENP-W的表达。4.CENP-W siRNA转染U251细胞后HIF-1α的表达无明显改变,提示U251细胞中CENP-W对HIF-1α的表达无明显影响。5.HIF-1α和CENP-W表达均与胶质瘤的病理级别呈正相关。HIF-1α可以调节CENP-W的表达。
【关键词】：着丝粒蛋白W RNA 小分子干扰 缺氧诱导因子1 α亚基
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.4
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-11
• 第1章 前言11-14
• 第2章 材料与方法14-25
• 2.1 实验材料14-17
• 2.1.1 标本来源14-15
• 2.1.2 胶质瘤细胞系来源15-16
• 2.1.3 主要材料和试剂16-17
• 2.1.4 主要仪器和设备17
• 2.2 实验方法17-25
• 2.2.1 免疫组织化学法检测HIF-1α 和CENP-W在脑胶质瘤中的表达17-19
• 2.2.2 细胞培养及氯化钴模拟缺氧实验19-22
• 2.2.3 实时荧光定量PCR方法检测相关mRNA的表达22-23
• 2.2.4. HIF-1α siRNA和CENP-W siRNA转染23-25
• 第3章 结果25-30
• 3.1 胶质瘤组织中CENP-W和HIF-1a表达呈正相关性25-27
• 3.2 氯化钴抑制HIF-1α 分解并上调CENP-W表达27-28
• 3.3 HIF-1α siRNA抑制HIFa表达后下调CENP-W表达28-29
• 3.4 CENP-W siRNA抑制CENP-W表达后对HIF-1α 表达无影响29-30
• 第4章 讨论30-34
• 第5章 结论与展望34-35
• 5.1 结论34
• 5.2 展望34-35
• 致谢35-36
• 参考文献36-39
• 发表论文和参加科研情况说明39-40
• 综述40-48
• 参考文献46-48

【参考文献】

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1 杨华;夏章勇;苗滢;李玉芹;陶勇;;缺氧诱导因子-1a和血清促红细胞生成素在脑出血患者中的表达及意义[J];中风与神经疾病杂志;2008年01期

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本文编号：374625