抑制纹状体GABA能神经元的活性可促进脑缺血损伤后的康复
发布时间：2023-03-22 18:10
GABA能神经元是纹状体中数量上占比最大的一类神经元,作为一种抑制性神经元,在成体动物的大脑内参与了神经再生过程。有文献报道,在卒中后小鼠的康复期内,抑制纹状体神经元的活性,可以促进神经再生并改善行为学功能。然而,GABA能神经元在卒中后的亚急性期对小鼠的康复发挥着什么样的作用,且其作用的机理又是什么,并不清楚。本课题采用光基因的方法并结合GAD2-Arch-GFP和GAD2-ChR2-tdTomato两种转基因小鼠,特异性地调控卒中后纹状体GABA能神经元的活性,探究其活性对小鼠卒中后的神经功能康复的影响及其作用机制。1.本课题运用GAD2-Arch-GFP和GAD2-ChR2-tdTomato两种转基因小鼠,用530纳米的绿光和473纳米的蓝光分别刺激GABA能神经元上特异性表达的光敏感通道蛋白Arch和ChR2,从而实现对GABA能神经元活性的抑制和激活,达到特异性调控其活性的目的。为了证明激光确实可调控纹状体GABA能神经元的活性,在第一章中,我们在光刺激的同时,也记录了神经元的电活动。发现在GAD2-Arch-GFP转基因小鼠中,无论是从局部场电位还是神经元的放电频率,530...
【文章页数】：127 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
绪论
第一章 光基因技术调控纹状体GABA能神经元的活性
1.1 引言
1.2 材料与方法
1.2.1 转基因小鼠的鉴定
1.2.2 电极的制作和埋植
1.2.3 激光的刺激及神经元电活动的记录
1.2.4 切片及免疫组化染色
1.2.5 大脑内光刺激范围测定
1.3 结果
1.3.1 转基因小鼠基因型鉴定
1.3.2 特定波长的激光可调控纹状体GABA能神经元的活性
1.3.3 GABA能神经元鉴定
1.3.4 小鼠脑内光刺激体积估算
1.4 讨论
1.5 本章小结
第二章 抑制纹状体GABA能神经元的活性促进小鼠卒中后的康复
2.1 引言
2.2 材料和方法
2.2.1 实验设计
2.2.2 MCAO模型
2.2.3 神经功能评分
2.2.4 旷场实验
2.2.5 牺牲小鼠,取脑切片
2.2.6 焦油紫染色及脑萎缩体积的测定
2.3 结果
2.3.1 抑制纹状体GABA能神经元的活性,可促进卒中后小鼠神经功能的康复
2.3.2 抑制纹状体GABA能神经元的活性,可重建卒中后小鼠的运动功能
2.3.3 抑制纹状体GABA能神经元的活性,减少了脑萎缩体积
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 抑制纹状体GABA能神经元的活性促进梗死边缘区血管密度的增加
3.1 引言
3.2 材料和方法
3.2.1 免疫荧光染色检测神经再生
3.2.2 TUNEL染色检测梗死边缘区凋亡细胞
3.2.3 CD31染色检测梗死边缘区血管密度
3.2.4 荧光定量及细胞计数
3.3 结果
3.3.1 抑制纹状体GABA能神经元的活性增加了SVZ区Nestin+细胞的数量
3.3.2 抑制纹状体GABA能神经元的活性减少了SVZ区 DCX+细胞的数量
3.3.3 抑制纹状体GABA能神经元的活性减少了梗死边缘区DCX+细胞的数量
3.3.4 抑制纹状体GABA能神经元的活性不影响BrdU+/NeuN+双阳性细胞的数量
3.3.5 抑制纹状体GABA能神经元的活性减少了梗死边缘区TUNEL+细胞的数量
3.3.6 抑制纹状体GABA能神经元的活性增加了梗死边缘区的血管密度
3.4 讨论
3.5 本章小结
第四章 抑制纹状体GABA能神经元的活性促进卒中后小鼠梗死边缘区bFGF的表达
4.1 引言
4.2 材料和方法
4.2.1 主要试剂与相关溶液配制
4.2.2 脑样本的收集
4.2.3 RNA的提取
4.2.4 Real Time-PCR
4.2.5 蛋白的提取
4.2.6 蛋白定量及Western
4.3 结果
4.3.1 抑制纹状体GABA能神经元的活性可促进bFGF表达
4.3.2 抑制纹状体GABA能神经元的活性可促进b FGF蛋白水平的表达
4.3.3 梗死边缘区分泌增多的bFGF主要来源于血管内皮
4.4 讨论
4.5 本章总结
第五章 抑制纹状体GABA能神经元对OGD细胞损伤后保护的体外验证
5.1 引言
5.2 材料和方法
5.2.1 主要试剂与相关溶液配制
5.2.2 神经元的原代培养
5.2.3 原代神经元及星形胶质细胞的共培养
5.2.4 原代神经元及血管内皮细胞的共培养
5.2.5 原代神经元、星形胶质细胞及血管内皮细胞共培养体系的建立
5.2.6 糖氧剥夺条件下的光刺激
5.2.7 乳酸脱氢酶试剂盒检测细胞活性
5.3 结果
5.3.1 GAD2-Arch-GFP转基因小鼠原代神经元的培养及鉴定
5.3.2 光刺激下双细胞培养体系及三种细胞培养体系的建立
5.3.3 光刺激三种细胞培养体系后的条件培液可提高OGD条件后细胞的活性
5.4 讨论
5.5 本章总结
全文总结
研究展望
参考文献
附录1 小鼠神经功能14分评分表
附录2 引物序列
附录3 中英文缩写字母表
致谢
攻读博士期间发表的论文
本文编号：3767342
【文章页数】：127 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
绪论
第一章 光基因技术调控纹状体GABA能神经元的活性
1.1 引言
1.2 材料与方法
1.2.1 转基因小鼠的鉴定
1.2.2 电极的制作和埋植
1.2.3 激光的刺激及神经元电活动的记录
1.2.4 切片及免疫组化染色
1.2.5 大脑内光刺激范围测定
1.3 结果
1.3.1 转基因小鼠基因型鉴定
1.3.2 特定波长的激光可调控纹状体GABA能神经元的活性
1.3.3 GABA能神经元鉴定
1.3.4 小鼠脑内光刺激体积估算
1.4 讨论
1.5 本章小结
第二章 抑制纹状体GABA能神经元的活性促进小鼠卒中后的康复
2.1 引言
2.2 材料和方法
2.2.1 实验设计
2.2.2 MCAO模型
2.2.3 神经功能评分
2.2.4 旷场实验
2.2.5 牺牲小鼠,取脑切片
2.2.6 焦油紫染色及脑萎缩体积的测定
2.3 结果
2.3.1 抑制纹状体GABA能神经元的活性,可促进卒中后小鼠神经功能的康复
2.3.2 抑制纹状体GABA能神经元的活性,可重建卒中后小鼠的运动功能
2.3.3 抑制纹状体GABA能神经元的活性,减少了脑萎缩体积
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 抑制纹状体GABA能神经元的活性促进梗死边缘区血管密度的增加
3.1 引言
3.2 材料和方法
3.2.1 免疫荧光染色检测神经再生
3.2.2 TUNEL染色检测梗死边缘区凋亡细胞
3.2.3 CD31染色检测梗死边缘区血管密度
3.2.4 荧光定量及细胞计数
3.3 结果
3.3.1 抑制纹状体GABA能神经元的活性增加了SVZ区Nestin+细胞的数量
3.3.2 抑制纹状体GABA能神经元的活性减少了SVZ区 DCX+细胞的数量
3.3.3 抑制纹状体GABA能神经元的活性减少了梗死边缘区DCX+细胞的数量
3.3.4 抑制纹状体GABA能神经元的活性不影响BrdU+/NeuN+双阳性细胞的数量
3.3.5 抑制纹状体GABA能神经元的活性减少了梗死边缘区TUNEL+细胞的数量
3.3.6 抑制纹状体GABA能神经元的活性增加了梗死边缘区的血管密度
3.4 讨论
3.5 本章小结
第四章 抑制纹状体GABA能神经元的活性促进卒中后小鼠梗死边缘区bFGF的表达
4.1 引言
4.2 材料和方法
4.2.1 主要试剂与相关溶液配制
4.2.2 脑样本的收集
4.2.3 RNA的提取
4.2.4 Real Time-PCR
4.2.5 蛋白的提取
4.2.6 蛋白定量及Western
4.3 结果
4.3.1 抑制纹状体GABA能神经元的活性可促进bFGF表达
4.3.2 抑制纹状体GABA能神经元的活性可促进b FGF蛋白水平的表达
4.3.3 梗死边缘区分泌增多的bFGF主要来源于血管内皮
4.4 讨论
4.5 本章总结
第五章 抑制纹状体GABA能神经元对OGD细胞损伤后保护的体外验证
5.1 引言
5.2 材料和方法
5.2.1 主要试剂与相关溶液配制
5.2.2 神经元的原代培养
5.2.3 原代神经元及星形胶质细胞的共培养
5.2.4 原代神经元及血管内皮细胞的共培养
5.2.5 原代神经元、星形胶质细胞及血管内皮细胞共培养体系的建立
5.2.6 糖氧剥夺条件下的光刺激
5.2.7 乳酸脱氢酶试剂盒检测细胞活性
5.3 结果
5.3.1 GAD2-Arch-GFP转基因小鼠原代神经元的培养及鉴定
5.3.2 光刺激下双细胞培养体系及三种细胞培养体系的建立
5.3.3 光刺激三种细胞培养体系后的条件培液可提高OGD条件后细胞的活性
5.4 讨论
5.5 本章总结
全文总结
研究展望
参考文献
附录1 小鼠神经功能14分评分表
附录2 引物序列
附录3 中英文缩写字母表
致谢
攻读博士期间发表的论文
本文编号：3767342
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/shenjingyixue/3767342.html
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