罗非鱼Foxp3表达细胞及其在实验性自身免疫性脑脊膜炎（EAE）中的作用

发布时间：2017-05-19 21:32

  本文关键词：罗非鱼Foxp3表达细胞及其在实验性自身免疫性脑脊膜炎（EAE）中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在哺乳类,大量研究表明,Foxp3是CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(regulatory T cells, Tr)发生、发育及发挥生物学活性的关键因素,在诱导和维持免疫耐受及免疫抑制功能中具有决定性作用。一直以来,Foxp3被认为限制性表达于CD4+CD25+Tr细胞中,但最近研究显示,在非淋巴组织如乳房、肺、前列腺等上皮细胞及多种非血源性肿瘤细胞均可检测到Foxp3的表达,从而表明,Foxp3除具有免疫调节功能外,可能在肿瘤的发生及演化等方面具有广泛的生物学功能。硬骨鱼类拥有与哺乳动物类似的T、B淋巴细胞,其抗原受体通过与哺乳动物类似的机制进行基因片段的随机组合、连接及突变产生。理论上,硬骨鱼类也能产生大量自身反应性淋巴细胞,但是否具有与哺乳动物类似的功能性免疫调节细胞及其分子如Foxp3,目前尚不明了。迄今,已相继从斑马鱼、虹鳟、大西洋鲑鱼、河豚、罗非鱼分离鉴定了Foxp3同源分子,但主要局限于mRNA水平的研究。硬骨鱼类Foxp3是否具有与哺乳类类似的细胞表达模式,目前尚未见报道。在前期研究中,我们从罗非鱼(在本研究中,如未特殊说明,研究用的罗非鱼均指尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus))分离并鉴定了Foxp3,并对其特异性片段(s-ntFoxp3)进行了原核表达。基于此,本研究通过进一步纯化s-ntFoxp3重组蛋白,制备了抗罗非鱼Foxp3兔源多克隆抗体(α Foxp3),通过SDS-PAGE、Western blot检测其特异性,并通过免疫组化、流式细胞仪等对其细胞表达模式进行深入研究；另一方面,通过自身脑抗原免疫,构建罗非鱼实验性自身免疫性脑脊膜炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)模型,检查Foxp3在EAE发生、发展过程中不同组织的表达变化情况,以期对其生物学作用进行探讨。主要研究结果如下：1) SDS-PAGE检测结果显示,获得的纯化重组蛋白s-ntFoxp3分子量大小与预期相符,Western blotting检测表明,在胸腺、脾、头肾、肠、肾、胃、鳃中均见与预测大小(约44 kD)相符的明显条带,而在肌肉组织中未见阳性条带,此结果与RT-PCR的结果相吻合,从而表明,α Foxp3具有较强的特异性。2)免疫组化结果显示,在体外分离的外周血单个核细胞(PBMC)中,Foxp3表达于部分淋巴样细胞,并主要定位于细胞核；流式细胞仪分析表明,正常成年罗非鱼PBMC中Foxp3+细胞所占百分率为5.7±2.0%(n=5)；有丝分裂原植物血凝素(PHA)体外刺激PBMC 6.12和24小时后,PBMC中Foxp3+细胞频率分别为21.9、19.1、7.86%,而未刺激组分别为738、6.47、2.70%。3)在免疫相关组织如胸腺、脾、头肾等,Foxp3主要表达于血源性淋巴样细胞；在非淋巴组织胃中,在非血源性的黏膜上皮细胞观察到Foxp3的阳性表达。4)用罗非鱼脑组织匀浆液与弗氏不完全佐剂充分乳化后,腹腔注射免疫罗非鱼,不同时间点观察罗非鱼行为、体重变化,结果显示,免疫后第12d左右,与对照组相比,实验组鱼行动减缓,反应迟钝、摄食量减少且体重增加量明显降低；HE染色观察脑组织、肾、肠、肝的病理变化,结果显示,免疫后第1、3、6、7、9d实验组鱼脑组织未见明显病理变化,第12d后,实验组鱼脑组织出现了类似于哺乳动物EAE的典型病理特征,即淋巴细胞浸润、脑膜增厚、血管袖套样等。此外,其他免疫相关组织也观察到不同程度的病理变化,主要为充血和淋巴细胞浸润。上述结果显示,通过脑抗原的自身免疫后罗非鱼出现了自身免疫性疾病,从而表明罗非鱼EAE模型构建成功。5)罗非鱼脑组织自身抗原免疫后,分离不同时间点的PBMC,流式细胞仪检测Foxp3+细胞频率,结果显示,免疫后第1-12 d,PBMC中Foxp3+细胞频率显著升高,第1、12d分别为63.6%、16.2%,而对照组分别为13.5%、7.98%,第15d开始,实验组PBMC中Foxp3+细胞频率明显低于对照组,第13、15、18d,PBMC中Foxp3+细胞频率分别为8%、3.34%、2.78%,对照组分别为,7.05%、5.37%、5.93%;real-timePCR及免疫组化分别检测免疫后不同时间点脾、头肾、肾中foxp3 mRNA及蛋白表达水平,结果显示,第12d前各组织Foxp3的表达均明显上调,第15 d Foxp3的表达显著减少,此结果与流式细胞仪结果一致。从而表明,在低等脊椎动物罗非鱼中,Foxp3的表达与自身免疫性疾病EAE的发生发展密切相关。本研究一方面成功制备了罗非鱼Foxp3的特异性抗体并检测了淋巴组织和非淋巴组织中的细胞表达类型,首次证实硬骨鱼类Foxp3不仅表达于血源性的淋巴样细胞而且表达于非淋巴组织的非血源性细胞。硬骨鱼与哺乳类Foxp3保守的细胞水平表达模式提示其可能具有保守的生物学功能；另一方面,成功构建了罗非鱼自身免疫性疾病模型,并通过多种方法检测了其发生发展过程中Foxp3的表达,提示在低等脊椎动物中Foxp3可能在自身免疫耐受中发挥了重要作用。
【关键词】：罗非鱼 Foxp3 淋巴样细胞 非血源性细胞 EAE
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R744.51
【目录】：

• 英文缩略词7-8
• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第1章 文献综述13-25
• 1 硬骨鱼类免疫13-20
• 1.1 主要免疫组织和器官14-17
• 1.2 T细胞表面特异分化抗原17-20
• 2 Foxp3研究现状及其在自身免疫性疾病中的表达20-22
• 2.1 Foxp3研究现状20-21
• 2.2 自身免疫性疾病21-22
• 2.3 EAE22
• 4 科学问题的提出和本研究的目的意义22-25
• 第2章 罗非鱼Foxp3表达细胞25-43
• 1 前言25
• 2 材料、仪器25-26
• 2.1 实验动物25-26
• 2.2 实验试剂和仪器26
• 3 实验方法26-33
• 3.1 重组蛋白表达与SDS-PAGE检测26-27
• 3.2 多克隆抗体制备27
• 3.3 组织表达模式分析27-28
• 3.4 Western blot28-29
• 3.5 PBMC中Foxp3的表达29-32
• 3.6 免疫组化32-33
• 4 结果与分析33-40
• 4.1 重组蛋白表达与SDS-PAGE结果33-34
• 4.2 组织表达模式分析34
• 4.3 Western blot检测34-35
• 4.4 PBMC中Foxp3的表达35-37
• 4.5 免疫相关组织中Foxp3细胞表达定位37-38
• 4.6 胸腺中Foxp3的细胞表达38-39
• 4.7 非免疫组织中Foxp3的细胞定位39-40
• 5 讨论40-43
• 第3章 罗非鱼Foxp3在实验性自身免疫性脑脊膜炎(EAE)的作用43-59
• 1 前言43
• 2 材料、仪器43
• 2.1 实验动物43
• 2.2 实验试剂和仪器43
• 3 实验方法43-46
• 3.1 实验组设置及免疫43-44
• 3.2 实验材料的收集与保存44
• 3.3 免疫组织组织学观察44-45
• 3.4 免疫组织Foxp3组织表达模式分析45-46
• 4 结果与分析46-55
• 4.1 自身免疫性疾病模型构建46-49
• 4.1.1 脑组织病理染色观察46-47
• 4.1.2 罗非鱼体重及行为变化47-48
• 4.1.3 免疫后病理组织染色48-49
• 4.2 Foxp3表达变化49-55
• 4.2.1 PBMC中Foxp3表达变化49-51
• 4.2.2 免疫后不同时间点免疫组织foxp3mRNA水平表达量的检测51-52
• 4.2.3 免疫组化检测免疫后不同时间点免疫组织中Foxp3的表达变化52-55
• 5 讨论55-59
• 结论59-61
• 参考文献61-75
• 致谢75-77
• 在读期间所发表的论文77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 王卫卫;吴谡琦;孙修勤;樊廷俊;;硬骨鱼免疫系统的组成与免疫应答机制研究进展[J];海洋科学进展;2010年02期

2 钟明超，黄浙;鲇鱼淋巴样器官的发育[J];水产学报;1995年03期

3 罗晓春,李安兴,谢明权;斜带石斑鱼黏膜免疫系统结构的研究[J];水生生物学报;2005年02期

4 刘云,姜国良,张士璀,姜明,连建华;牙鲆的头肾免疫细胞[J];中国水产科学;2001年04期

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本文编号：379940