骨髓间充质干细胞来源的外泌体对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的免疫调节作用的实验研究

发布时间：2023-05-14 07:36

　　目的:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种慢性脱髓鞘疾病,多由中枢神经系统(central nervous system,CNS)炎症和自身免疫功能障碍引起,通常导致患者严重的终身残疾。目前没有可以治愈MS的方法,治疗主要依靠疾病修饰药物和对症治疗药物,减慢疾病进展从而减少疾病复发和严重程度。干细胞治疗在临床研究和多种疾病模型中均被证实能有效减轻神经系统损伤,减缓疾病的进展。最近的研究表明,外泌体参与的旁分泌作用可能是干细胞发挥效应的主要途径,骨髓间充质干细胞的外泌体在许多自身免疫性疾病和组织损伤中发挥着治疗作用。小胶质细胞作为CNS的免疫监视细胞,其M1/M2表型相互转化的比例失衡,参与MS的发生发展,影响疾病进程。本研究采用骨髓间充质干细胞的外泌体治疗MS动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型,探讨外泌体治疗对疾病大鼠行为学评分和CNS病理改变的影响,以及治疗前后脊髓内小胶质细胞M1/M2两种表型比例的数量变化,明确外泌体是否影响小胶质细胞极化进而减轻MS的严重...

【文章页数】：111 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分 :大鼠骨髓间充质干细胞及其外泌体的提取及鉴定
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
            2.1.3 实验动物
            2.1.4 主要工作液配制
        2.2 原代大鼠骨髓间充质干细胞的分离提取
            2.2.1 实验动物取材
            2.2.2 原代细胞接种
            2.2.3 传代培养
            2.2.4 细胞计数
            2.2.5 细胞冻存
            2.2.6 细胞复苏
        2.3 大鼠原代骨髓间充质干细胞的鉴定
            2.3.1 细胞形态观察
            2.3.2 细胞生长曲线绘制
            2.3.3 细胞表面标志物鉴定
            2.3.4 骨髓间充质干细胞成骨分化诱导
            2.3.5 骨髓间充质干细胞成脂分化诱导
            2.3.6 骨髓间充质干细胞成软骨分化诱导
        2.4 大鼠原代骨髓间充质干细胞外泌体的分离提取和鉴定
            2.4.1 外泌体的分离提取
            2.4.2 外泌体形态观察
            2.4.3 外泌体蛋白浓度测定
            2.4.4 外泌体表面标志物鉴定
    3 结果
        3.1 原代骨髓间充质干细胞的培养
        3.2 骨髓间充质干细胞的鉴定
        3.3 骨髓间充质干细胞来源的外泌体特性鉴定
    4 讨论
    5 结论
第二部分 :骨髓间充质干细胞来源的外泌体对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的治疗作用
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
            2.1.3 实验细胞
            2.1.4 主要试剂配制
        2.2 实验动物和分组
            2.2.1 实验动物
            2.2.2 实验分组
        2.3 实验方法和步骤
            2.3.1 EAE模型建立
            2.3.2 实验动物体重及行为学评分监测
            2.3.3 脑和脊髓组织固定、包埋及切片
            2.3.4 脑和脊髓组织病理染色
            2.3.5 脊髓组织免疫荧光染色
            2.3.6 实时荧光定量PCR
            2.3.7 酶联免疫吸附试验
            2.3.8 统计分析
    3 结果
        3.1 构建EAE大鼠动物模型
        3.2 各组大鼠体重和行为学改变比较
        3.3 各组大鼠脑和脊髓病理学改变比较
        3.4 各组大鼠体内细胞因子分泌情况
        3.5 各组大鼠脊髓小胶质细胞表面标志物的表达情况
    4 讨论
    5 结论
第三部分 :骨髓间充质干细胞的外泌体对小胶质细胞的免疫调节作用及初步机制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
        2.2 实验细胞和分组
            2.2.1 实验细胞
            2.2.2 主要试剂配制
            2.2.3 细胞培养
            2.2.4 实验分组
        2.3 实验方法和步骤
            2.3.1 共培养体系构建
            2.3.2 各组小胶质细胞M1/M2 相关标志物mRNA的水平
            2.3.3 各组小胶质细胞细胞因子分泌情况
            2.3.4 各组小胶质细胞分泌NO水平
            2.3.5 shotgun检测
            2.3.6 Label-free检测外泌体处理前后小胶质细胞差异蛋白表达谱
            2.3.7 生物信息学分析
            2.3.8 PRM验证
            2.3.9 统计分析
    3 结果
        3.1 NO水平检测
        3.2 细胞因子水平检测
        3.3 小胶质细胞M1/M2 表型相关标志物mRNA水平检测
        3.4 外泌体功能蛋白表达谱
        3.5 外泌体处理前后小胶质细胞差异蛋白表达谱及生物信息学分析
        3.6 PRM验证
    4 讨论
    5 结论
本论文创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历



本文编号：3817468