CRISPR/cas9介导的Cdk5基因组次级运动皮层（M2）敲除对小鼠运动功能调控及机制研究

发布时间：2023-08-06 13:31

　　目的中枢神经系统退行性疾病是以神经系统中特定的神经元损伤、丢失为主要病理特征的疾病。细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cdk5)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,涉及突触可塑性、行为和认知。在神经退行性疾病病理状态下Cdk5过渡活化导致突触密度降低的同时增加β淀粉样蛋白(Aβ)生成,随后在大脑中导致持续的神经退行性病变。次级运动皮层(M2)在以运动异常为特征的神经退行性疾病中发挥重要作用。CRISPR-Cas9基因编辑系统可以准确、高效地编辑高等生物的细胞基因组DNA,因此在各种人类疾病的基因治疗中展现出广阔的应用前景。本课题构建一个CRISPR/Cas-Cdk5基因组编辑系统,基于次级运动皮层(M2)区Cdk5基因的表达调控,在正常小鼠率先作了初步有效性研究以及作用机制探讨,研究Cdk5对次级运动皮层(M2)神经环路调控及运动功能特异性调控作用,为对后续神经退行性疾病的治疗研究奠定基础。方法1.Cdk5-sgRNA慢病毒载体的设计及体内体外表达验证设计了三对不同的sgRNA序列,并使用CRISPR-Cas9基因编辑策略进行了合成。并将它们分别载入慢病毒载体GV393的相应表达框内,从而构建出针对Cd...

【文章页数】：94 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
符号说明
前言
第一部分 :CRISPR-Cas9介导的Cdk5基因敲除慢病毒表达载体的构建及验证
    1.实验材料
    2.试验方法
        2.1 主要试剂配制
        2.2 CRISPR-Cas9编辑Cdk5基因敲除sgRNA设计及载体合成
            2.2.1 sgRNA序列设计
            2.2.2 慢病毒载体的选择
            2.2.3 病毒合成及滴度测定
        2.3 HEK293-T细胞体外活性筛选验证
            2.3.1 HEK293-T细胞分盘
            2.3.2 转染前换液
            2.3.3 转染
            2.3.4 观察感染效率
        2.4 体内M2区立体定位注射表达验证
            2.4.1 实验流程
            2.4.2 慢病毒次级运动皮层(M2)脑立体定位注射
            2.4.3 免疫组化验证
            2.4.4 Western blot检测转染细胞表达情况
        2.5 统计分析方法
    3.结果
        1.Cdk5-sgRNA序列设计结果
        2.CRISPR-Cas9介导的Cdk5基因敲除慢病毒表达载体体外初筛结果
        3.CRISPR-Cas9介导的Cdk5基因敲除慢病毒表达载体M2区表达结果
        4.CRISPR-Cas9介导的Cdk5基因敲除慢病毒载体M2区表达降低了Cdk5蛋白浓度
    4.小结
第二部分 :M2区神经元Cdk5缺失对小鼠运动调控作用及机制研究
    1.实验材料
    2.试验方法
        2.1 行为学检测
            2.1.1 自发活动行为检测
            2.1.2 转棒实验
        2.2 神经元高尔基染色
        2.3 PSD-95免疫荧光染色
        2.4 膜片钳系统记录兴奋性突触后电流
        2.5 次级运动皮层逆行投射强度示踪
        2.6 统计分析
    3.结果
        3.1 M2区Cdk5缺失后小鼠运动能力受损
        3.2 M2区V层锥体神经元Cdk5基因缺失后树突长度和脊柱密度降低
        3.3 Cdk5缺乏会影响M2区神经元的基础突触传递功能
        3.4 M2区Cdk5缺乏降低该区域向丘脑,前额叶皮质和屏状核的信号投射强度
    4.小结
讨论
全文结论与展望
参考文献
综述
    综述参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
个人简历
开题、中期及学位论文答辩委员组成



本文编号：3839503