PIWIL1/piRNA-DQ593109、RBFOX1调节血肿瘤屏障通透性的机制研究

发布时间：2023-08-17 18:49

　　目的:脑胶质瘤是人脑部最常见及原发性的恶性肿瘤,目前治疗脑胶质瘤的方法是手术切除,结合术后放疗和化疗。血肿瘤屏障(blood tumor barrier,BTB)极大地限制了大多数的化疗药物进入肿瘤组织中,降低了化疗的疗效。因此,选择性开放BTB以增加脑肿瘤组织中的药物浓度对于提高化学疗法治疗恶性神经胶质瘤的有效性至关重要。PIWI(P-element-induced wimpy testis)蛋白属于Argonaute(AGO)家族,参与癌症发生的生物学过程。PIWI蛋白识别并结合PIWI相互作用RNA(piRNA),构成piRNA诱导的沉默复合体(piRISC),在表观遗传调控、转座子沉默等发挥重要的作用。PIWIL1(Piwi‐like RNA‐mediated gene silencing 1)是PIWI蛋白家族中的一员,能促进胶质瘤的增殖、迁移和抑制其凋亡。然而,PIWIL1在人脑微血管内皮细胞中的表达及功能,目前尚未见报道。PiRNAs(Piwi-interacting RNA)是长度为23-32个核苷酸(nt)的非编码RNA。最近研究表明,piRNAs在癌症的发生发展过程...

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【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分 :PIWIL1/pi RNA-DQ593109 通过MEG3/mi R-330-5p/RUNX3 轴调控血肿瘤屏障通透性的机制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 主要实验细胞株
            2.1.2 主要实验试剂
            2.1.3 主要的实验仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 细胞培养
            2.2.2 细胞换液、传代
            2.2.3 细胞冻存
            2.2.4 细胞复苏
            2.2.5 体外血肿瘤屏障模型的建立
            2.2.6 实时荧光定量PCR方法分别检测PIWIL1 m RNA、pi RNA-DQ593109、MEG3、mi R-330-5p和 RUNX3 m RNA的表达变化
                2.2.6.1 细胞总RNA提取
                2.2.6.2 基因组去除DNA反应
                2.2.6.3 反转录反应
                2.2.6.4 PCR反应
                2.2.6.5 探针法实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测pi RNA-DQ593109 及miR-330-5p的表达
            2.2.7 细胞的转染
                2.2.7.1 沉默PIWIL1质粒的稳定转染
                2.2.7.2 piR-DQ593109沉默质粒转染
                2.2.7.3 miR-330-5p过表达和沉默质粒转染
                2.2.7.4 MEG3质粒的稳定转染
                2.2.7.5 RUNX3过表达和沉默质粒稳定转染
                2.2.7.6 PIWIL1与pi R-DQ593109与MEG3 共转染
                2.2.7.7 MEG3与mi R-330-5p共转染
                2.2.7.8 mi R-330-5p与 RUNX3 共转染
            2.2.8 双荧光素酶报告基因检测
                2.2.8.1 明确MEG3与pi R-DQ593109 的结合作用及结合位点
                2.2.8.2 明确MEG3与mi R-330-5p结合作用及结合位点
                2.2.8.3 明确RUNX33’-UTR与 mi R-330-5p结合作用及结合位点
            2.2.9 跨内皮阻抗值(TEER)检测
            2.2.10 辣根过氧化(HRP)渗出量的检测
            2.2.11 Western blot
            2.2.12 免疫荧光
            2.2.13 RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验
            2.2.14 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验
        2.3 统计方法
    3 实验结果
        3.1 在GECs中 PIWIL1 高表达,沉默PIWIL1 的表达增加BTB通透性,降低ZO-1、occludin和 claudin-5 的表达
        3.2 在GECs中 pi R-DQ593109 高表达,沉默pi R-DQ593109 的表达增加BTB通透性,降低ZO-1、occludin和 claudin-5 的表达
        3.3 在GECs中 MEG3 低表达,过表达MEG3 增加BTB通透性,降低ZO-1、occludin和 claudin-5 的表达
        3.4 PIWIL1/ pi R-DQ593109 复合物以序列特定的方式调节MEG3 的表达
        3.5 MEG3 靶向结合并负性调控mi R-330-5p的表达
        3.6 在GECs中 mi R-330-5p高表达,沉默mi R-330-5p的表达增加BTB的通透性
        3.7 mi R-330-5p介导MEG3对BTB通透性的调控
        3.8 mi R-330-5p靶向结合RUNX
        3.9 RUNX3在GECs中低表达,过表达RUNX3 增加BTB通透性,并在转录水平抑制ZO-1,occludin和 claudin-5 的表达
        3.10 RUNX3 参与mi R-330-5p对 BTB通透性的调控
        3.11 RUNX3 显著降低ZO-1,occludin和 claudin-5 启动子的活性
    4 讨论
    5 结论
第二部分 :RBFOX1 介导LINC00673 通过SMD途径降解MAFF m RNA调控血肿瘤屏障通透性的机制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 材料与试剂
            2.1.1 实验细胞株和组织样本
            2.1.2 主要实验试剂
            2.1.3 主要实验仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 细胞的培养、冻存、复苏
            2.2.2 实时定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)
            2.2.3 构建稳定转染RBFOX1、LINC00673、MAFF过表达与表达沉默的细胞系及分组
            2.2.4 跨内皮电阻值(TEER)
            2.2.5 辣根过氧化物酶(HRP)
            2.2.6 western blot
            2.2.7 染色质免疫沉淀实验(ChIP)
            2.2.8 双荧光素酶报告基因表达分析
            2.2.9 细胞免疫荧光染色实验
            2.2.10 RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验
            2.2.11 细胞凋亡实验
            2.2.12 Click-i T Nasent RNA Capture Kit方法捕获新合成RNA
        2.3 统计方法
    3 实验结果
        3.1 RBFOX1在GECs中低表达,过表达RBFOX1 增加BTB的通透性并且降低ZO-1、occludin和 claudin-5 的表达
        3.2 LINC00673在GECs中高表达,沉默LINC00673 增加BTB的通透性,降低ZO-1、occludin和 claudin-5 的表达
        3.3 在GECs中 RBFOX1 靶向结合LINC00673,降低LINC00673 的稳定性,并且LINC00673 介导RBFOX1 调控BTB的通透性。
        3.4 MAFF是 LINC00673 的下游靶基因,LINC00673 通过Staufen1(STAU1)介导的m RNA降解(SMD)方式下调MAFF的表达
        3.5 MAFF介导LINC00673 调控BTB的通透性
        3.6 MAFF在 GECs中低表达,过表达MAFF增加BTB通透性,降低ZO-1、occludin和 claudin-5 的表达
        3.7 MAFF结合紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-5 启动子区并降低其活性
        3.8 过表达RBFOX1 联合沉默LINC00673 能够促进阿霉素通过BTB输送到肿瘤组织中,促进脑胶质瘤的凋亡
    4 讨论
    5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简介



本文编号：3842377