SD大鼠神经干细胞的分离培养与鉴定

发布时间：2017-05-25 04:06

  本文关键词：SD大鼠神经干细胞的分离培养与鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种与年龄相关的神经系统退行性疾病。既往研究认为成年哺乳动物中枢神经系统细胞无再生能力,当成年动物脑或脊髓内的神经细胞因损伤、疾病及自然凋亡等因素逐渐减少,而不能被其他细胞更新、替代；进而出现神经系统退行性疾病。神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是一种具有多分化潜能细胞,能通过对称分裂、不对称分裂产生子代神经干细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。假如能够将神经干细胞定向诱导分化,并且通过移植进入机体,可能可以为治疗以帕金森病为代表的神经系统退行性疾病提供一个新的途径。目的：从孕14d胚胎SD大鼠(Sprague-Dawley,SD)中脑分离神经干细胞,并且进行培养、诱导分化及鉴定。方法：1.神经干细胞的分离：取孕14d胚胎SD大鼠断头处死,置于体积分数为75%乙醇中浸泡消毒15 min,无菌条件下取出全脑,置于PBS培养皿中,切除小脑、脑干、脑膜、血管等,无菌解剖分离胚胎腹侧中脑组织,并且剪成1 mm3的碎块,D-Hanks液漂洗后,火焰抛光的吸管吹打、200目筛网过滤制备成单细胞悬液。离心(800 r/min,离心半径10cm) 5min×3次,去除上清液,调整细胞密度至2×105个/ml,神经干细胞完全培养液DMEM/F12(Hyclone)、1% N2(Gibeo).20ng/ml表皮生长因子(RD Systems),20 ng/ml碱性成纤维生长因子(R8LD Systems)],37℃,5%CO2培养。2.神经干细胞的培养：用不含血清的培养基(DMEM/F12,碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、N2)培养,每天观察细胞的生长情况,2-3 d半量换液,5-7 d即可传代。传代时,离心收集神经球,机械吹打使其分散成单个细胞,以1×105个/ml的密度传代,37℃,5%CO2继续培养。比较分离效果时,倒置显微镜观察细胞形态,测定第3代细胞的生长曲线。3.神经干细胞的鉴定：离心收集神经球,以神经干细胞分化培养液VDMEM/F12、1%胎牛血清(Gibeo)、1%N2]重悬,接种于预先放置多聚赖氨酸包被盖玻片的培养板中,37℃,5%CO2培养1 h,进行Nestin(Abeam)免疫细胞化学鉴定。4.神经干细胞的诱导分化：离心收集神经球,以神经干细胞分化培养液(DMEM/F12、1%胎牛血清、1%N2)重悬,接种于预先放置多聚赖氨酸包被盖玻片的培养板中,370℃,5%CO2培养箱培养7 d。每天观察细胞的分化情况,7 d后分别进行CD11c、GFAP和NeuN免疫细胞化学鉴定细胞的分化情况。结果：1.神经干细胞的分离培养：24h后,大部分细胞贴壁,单个或成对存在；48h后,可见到哑铃型的细胞分裂相；72h后,数十个细胞聚集成细胞团,悬浮生长；继续培养,细胞迅速增加,细胞团不断增大,细胞团逐渐形成神经球(neu-rosphere);6-7d后神经球长大至200μm左右即可传代。2.神经干细胞的鉴定：第3代神经球置于神经干细胞分化培养基中培养1h后贴壁,使用神经干细胞特异性标志物Nestin;进行免疫细胞化学染色,结果显示Nestin免疫反应阳性。3.神经干细胞的诱导分化：第3代神经球置于神经干细胞分化培养基中培养1h后贴壁,培养72h后大量细胞从神经球中长出突起。7d后进行免疫细胞化学染色。结果显示NeuN免疫反应阳性的为神经元,GFAP免疫反应阳性的为星形胶质细胞,CDllc免疫反应阳性的为少突胶质细胞。结论：分离和培养的细胞经过神经干细胞特异性标志物Nestin进行细胞化学染色结果呈阳性,诱导分化的细胞分别使用GFAP、CD11c、NeuN进行细胞化学染色结果呈阳性,并且具有很强的增殖能力和多向分化潜能,证明分离培养的细胞是神经干细胞,证明胚胎SD大鼠中脑存在神经干细胞,可能可以为治疗以帕金森病为代表的神经系统退行性疾病提供一个新的途径。
【关键词】：神经干细胞 分离培养 鉴定
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.5
【目录】：

• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 符号说明13-15
• 引言15-17
• 1. 材料17-21
• 1.1 主要仪器设备17-18
• 1.2 实验试剂及材料18-19
• 1.3 实验动物19
• 1.4 试剂配制19-21
• 2. 方法21-26
• 2.1 神经干细胞的分离培养21-24
• 2.1.1 原代细胞的培养21-22
• 2.1.2 神经干细胞传代培养22-23
• 2.1.3 死活细胞的分离23
• 2.1.4 神经干细胞的冻存23
• 2.1.5 神经干细胞的复苏23-24
• 2.2 神经干细胞的鉴定24-25
• 2.2.1 Nestin免疫荧光化学染色24
• 2.2.2 神经干细胞的分化鉴定24-25
• 2.3 神经干细胞的诱导分化25-26
• 3. 结果26-32
• 3.1 神经干细胞的分离培养26-28
• 3.1.1 原代细胞的培养26-27
• 3.1.2 神经干细胞传代培养27-28
• 3.2 神经干细胞及神经干细胞诱导分化的鉴定28-30
• 3.3 神经干细胞的复苏30-32
• 4. 讨论32-36
• 5. 结论36-37
• 参考文献37-41
• 综述41-47
• 参考文献45-47
• 论文发表情况47-48
• 致谢48

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 钱晓丹;罗春霞;朱东亚;;神经干细胞移植研究进展[J];中国细胞生物学学报;2012年03期

2 杜绒贵;;神经干细胞移植治疗帕金森病的研究与应用[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年50期

3 赵际童;沈强;黄斐;;无血清神经球培养下神经干细胞的生长与分化[J];中国组织工程研究;2013年14期

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本文编号：392671