肝豆状核变性遗传和致病机制研究

发布时间：2024-04-24 01:04

　　目的：1.检测2010年9月至2012年12月间中南大学湘雅三医院就诊的9个中国汉族肝豆状核变性(Wilson’s disease, WD)患者及家系的ATP7B基因突变类型及突变频率,并进行单体型分析。2.分析肝豆状核变性患者临床特点,鉴定基因型和表型之间的关系。 方法：应用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)和基因测序法,检测9个肝豆状核变性患者、部分家系成员及正常对照的ATP7B基因突变情况。 结果：1.9个WD家系中发现1个纯合子ATP7B基因突变家系和8个复合杂合子ATP7B基因突变家系。总共有11种突变类型,包括1个无义突变(p.Ser105X)、1个移码突变(c.1708-1G>C)和9个错义突变(p.Arg778Leu、p.Pro840Leu、p.Ala874Pro、p.Thr888Pro p.Thr935Met、p.Pro992Leu、p.Asp1047Val、p.Ile1148Thr和p.Glu1173Lys),但9例WD患者中未发现新突变。同时在ATP7B基因突变检测过程中发现有8种多态,包括p.Ile390Val、...

【文章页数】：112 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
目录
符号说明
第一部分 肝豆状核变性家系ATP7B基因突变筛查和单体型分析
    1 前言
    2 对象和方法
        2.1 研究对象
            2.1.1 肝豆状核变性家系
            2.1.2 正常对照组
        2.2 研究器材和试剂
            2.2.1 主要器材
            2.2.2 主要试剂
            2.2.3 主要配剂
            2.2.4 主要的计算机分析软件和数据库
        2.3 研究方法和步骤
            2.3.1 DNA准备
            2.3.2 引物设计
            2.3.3 PCR(Polymerse chain reaction,聚合酶链反应)反应
            2.3.4 PCR产物鉴定
            2.3.5 测序
            2.3.6 单体型分析
            2.3.7 Hardy-Weinberg平衡吻合度测验
    3 结果
        3.1 家系突变筛查结果
            3.1.1 家系筛查结果
            3.1.2 突变位点结果分析
            3.1.3 多态位点结果分析
            3.1.4 单体型分析
            3.1.5 临床资料分析
    4 讨论
        4.1 肝豆状核变性的临床特征
        4.2 致病基因
        4.3 ATP7B基因突变
        4.4 WD表型及与基因型可能的关系
    5 结论
    参考文献
第二部分 ATP7B siRNA干扰对HepG2细胞活性、凋亡及下游蛋白的影响
    1 前言
    2 对象和方法
        2.1 实验细胞株
        2.2 研究方法步骤
            2.2.1 主要仪器
            2.2.2 主要试剂及材料
            2.2.3 主要配剂
        2.3 研究方法和步骤
            2.3.1 Small interfering RNA(小分子干扰RNA,siRNA)转染
            2.3.2 引物设计
            2.3.3 提取总RNA
            2.3.4 逆转录反应
            2.3.5 相对定量荧光PCR(real-time RT-PCR)
            2.3.6 Western Blot
            2.3.7 MTT法测定细胞相对数和相对活力
            2.3.8 细胞凋亡测定
            2.3.9 电镜观察细胞凋亡
    3 结果
        3.1 ATP7BsiRNA干扰结果分析
        3.2 Hoechst 33342染色结果分析
        3.3 电镜结果分析
        3.4 MTT结果
        3.5 MCM7、SREBP1、BCL2和BAX基因mRNA表达结果分析
        3.6 Western blot结果分析
    4 讨论
    5 结论
    参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间主要的研究成果
致谢



本文编号：3963004