重组微小腺病毒载体对Wilson病患者皮肤成纤维细胞铜代谢的影响

发布时间：2017-06-12 14:00

  本文关键词：重组微小腺病毒载体对Wilson病患者皮肤成纤维细胞铜代谢的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景Wilson病又称肝豆状核变性,由ATP7B基因突变引起的常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病。目前Wilson病的治疗方法主要包括：①锌剂治疗,②以金属络合剂为代表的驱铜治疗,③肝移植治疗。以青霉胺为代表的金属络合剂属于对症驱铜治疗,其对早期阶段Wilson病有一定疗效,部分患者经治疗后得以基本恢复正常的工作和生活,但患者须终身服药,且药物副作用大,高达70%的患者出现副作用,部分患者难以坚持。肝移植治疗,因其肝来源有限、存在免疫排斥反应等问题,故临床应用有限。基于上述传统治疗的局限性,人们开始逐步探讨Wilson病的基因治疗。Wilson病是单基因遗传病,基因治疗是最根本的治疗方法。目的探讨重组微小腺病毒载体miniAd-ATP7B-GFP对高铜孵育下的Wilson病患者皮肤成纤维细胞铜代谢的影响。方法构建含人ATP7B基因的重组微小腺病毒载体；检测8例Wilson病患者的突变基因；原代培养8例Wilson病患者与8名健康对照的皮肤成纤维细胞,使用基本培养液及铜浓度为22.30(C1)、89.20(C2)、156.1(C3)、245.3 μmol/L (C4)培养液分别孵育2组细胞72 h,检测铜与蛋白含量。向Wilson病患者成纤维细胞分别转染ATP7B重组微小腺病毒载体miniAd-ATP7B-GFP (miniAd-ATP7B-GFP组)与空载体病毒(miniAd-GFP组),设立Wilson病未转染组及健康组做对照,用C4浓度培养液孵育4组细胞72、96h,后检测各组细胞铜与蛋白含量。结果8例Wilson病患者检出5种突变基因,基本培养液及C1～C3组Wilson病患者与健康人铜/蛋白比值差异无统计学意义,C4组Wilson病患者[(1871.6±209.2)ng/mg]与健康入[(1267.2±188.3)ng/mg]铜/蛋白比值差异有统计学意义(t=-6.075,P0.01),C3、C4组较基本培养液组差异有统计学意义(患者组x2=31.493,健康组贮=30.708,均P0.01)。96 h各组铜/蛋白比值均高于72 h组,96 h、72 h的miniAd-ATP7B-GFP组铜/蛋白比值[96h(2071.0±171.8)ng/mg,72 h(1495.5±161.4)ng/mg]与Wilson病未转染组[96 h(2731.2±188.7)ng/mg,72 h(1901.7±219.5)ng/mg]相比差异有统计学意义(72 h组F=20.130,96 h组F=51.496,P0.01),与健康组比差异亦有统计学意义。结论MiniAd-ATP7B-GFP对高铜孵育下的Wilson病患者皮肤成纤维细胞的铜代谢有部分改善作用。
【关键词】：肝豆状核变性 皮肤成纤维细胞 铜浓度
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.4
【目录】：

• 中英文缩略表6-7
• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 1 前言10-14
• 2 实验材料与方法14-31
• 2.1 实验材料14-17
• 2.1.1 实验标本14-15
• 2.1.2 主要仪器15-16
• 2.1.3 主要试剂16-17
• 2.2 实验方法17-31
• 2.2.1 试剂的配制17-18
• 2.2.2 构建构建含ATP7B基因的重组穿梭质粒18-26
• 2.2.3 miniAd5-ATP7B-EGFP重组腺病毒包装与纯化26-28
• 2.2.4 直接测序法检测突变基因28
• 2.2.5 皮肤成纤维细胞原代培养28
• 2.2.6 皮肤成纤维细胞波形蛋白免疫化学鉴定28-29
• 2.2.7 高铜孵育皮肤成纤维细胞29
• 2.2.8 腺病毒转染成纤维细胞29-30
• 2.2.9 铜含量与蛋白含量测定30-31
• 2.3 统计学方法31
• 3 实验结果31-35
• 4 讨论35-38
• 5 结论38
• 参考文献38-43
• 综述43-49
• 参考文献47-49

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