泛素化和苏素化修饰对α-突触核蛋白降解的影响

发布时间：2017-06-13 05:07

  本文关键词：泛素化和苏素化修饰对α-突触核蛋白降解的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)是一种包含有140个氨基酸的小分子酸性蛋白质。α-Syn普遍存在于脑部神经元内。α-Syn基因的缺失或突变,会引起多种神经疾病,特别是诱发常染色体显性遗传性帕金森病。然而,α-Syn突变体诱发帕金森病的确切机制在很大程上仍未有明确定论。蛋白质翻译后修饰与神经退行性疾病的关系是近年来的研究热点,尤其是对蛋白质的苏素化(SUMOylation)、泛素化(Ubiquitination)以及磷酸化(phosphorylation)的研究。但α-Syn的苏素化、泛素化与α-Syn降解过程的研究报道较少。因此,这项研究中,我们主要探讨苏素(Small ubiquitin-related modifier protein,SUMO)和泛素(Ubiquitin)在α-Syn降解途径中的作用,揭示SUMO和Ubiquitin对α-Syn的降解通路转换的影响。研究结果将丰富帕金森病发病过程中蛋白质降解的机理。本实验首先用两步法PCR技术构建带有Flag标签的野生型和突变型Ubiquitin真核表达质粒,即Flag-Ubiquitin WT、K29A、K48A、K63A以及双突变型G75AG76A。通过双酶切和基因测序确定序列的正确性;通过Western Blot方法确定重组质粒在细胞上的表达;通过免疫荧光标记技术了解野生型和突变型Flag-Ubiquitin在细胞内分布特征;通过LDH和WST-1的检测分析野生型和突变型Flag-Ubiquitin的细胞毒性。发现野生型和突变型Flag-Ubiquitin多分布于细胞胞浆,但在细胞核内也有少量分布。突变型FlagUbiquitin均有不同程度的细胞毒性,其中Flag-Ubiquitin G75AG76A的毒性最大。其次,B103细胞分别瞬时转染α-Syn WT和A53T质粒,然后用浓度为200μg/m L的Hygromycin B建立具有抗性筛选的稳定表达α-Syn WT、A53T的两种B103细胞株。最后,在稳定表达α-Syn WT和A53T的B103细胞株上,分别瞬时转染重组质粒Flag-Ubiquitin,通过免疫荧光标记分别检测α-Syn与SUMO、Ubiquitin以及与26S蛋白酶体定位结合情况。结果发现在B103细胞内,Ubiquitin与SUMO无明显共定位现象,而在稳定转染α-Syn的细胞内,却发现α-Syn与Ubiquitin、SUMO和26S蛋白酶体以及Ubiquitin与SUMO均有明显的共定位现象,修饰的α-Syn一部分由泛素介导的蛋白酶体系统降解。总之,突变型Flag-Ubiquitin产生的细胞毒性不同,这与它们在细胞内的分布特征以及形成的聚集体有很大关系。α-Syn能同时与Ubiquitin和SUMO结合,被泛素和SUMO修饰,形成α-Syn的泛素复合物以及α-Syn的SUMO复合物,并且在Ubiquitin与SUMO两者之间,可能存在着某种机制能够使Ubiquitin与SUMO相互作用共同修饰α-Syn,修饰的α-Syn一部分经由泛素介导的蛋白酶体系统降解。
【关键词】：帕金森病 α-突触核蛋白 苏素 泛素 泛素蛋白酶体系统
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.5
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 1 引言10-18
• 1.1 帕金森病及其病理学特征10
• 1.2 α-突触核蛋白 (α-Syn)10-12
• 1.2.1 α-Syn的分子结构特征10-11
• 1.2.2 α-Syn的聚集与路易包涵体的形成11-12
• 1.2.3 α-Syn与氧化应激12
• 1.3 α-Syn的蛋白质翻译后修饰——SUMO化和泛素化修饰12-15
• 1.3.1 α-Syn的苏素化修饰 (SUMOylation)13-14
• 1.3.2 α-Syn的泛素化修饰 (ubiquitination)14-15
• 1.4 α-Syn的降解通路15-18
• 1.4.1 自噬溶酶体途径 (ALP)16
• 1.4.2 泛素介导的蛋白酶体降解系统 (UPS)16-18
• 2 材料与方法18-32
• 2.1 构建 α-Syn突变型和Flag-Ubiquitin野生型及突变型重组质粒质粒18-24
• 2.1.1 主要仪器与设备18
• 2.1.2 常用试剂及配制18-20
• 2.1.3 实验步骤20-24
• 2.2 突变体 α-Syn G51D和Flag-Ubiquitin野生型和突变型重组载体的表达与稳转细胞系的建立24-29
• 2.2.1 主要仪器与设备24-25
• 2.2.2 常用试剂及配制25-26
• 2.2.3 实验步骤26-29
• 2.3 免疫荧光标记和细胞活性、凋亡检测29-32
• 2.3.1 实验仪器与设备29
• 2.3.2 常用试剂及配制29-30
• 2.3.3 实验步骤30-32
• 3 结果与分析32-50
• 3.1 突变型 α-Syn G51D和野生型及突变型Flag-Ubiquitin重组质粒的构建以及在B103细胞内的表达32-34
• 3.1.1 重组质粒的构建32-33
• 3.1.2 重组质粒在B103细胞内的表达检测33-34
• 3.2 重组质粒 α-Syn、Flag-Ubiquitin野生型及其突变型在细胞内的分布和对细胞存活的影响34-38
• 3.2.1 α-Syn野生型及其突变体在B103细胞内的分布及细胞毒性检测34-36
• 3.2.2 Flag-Ubiquitin野生型及其突变体细胞内的分布及细胞毒性检测36-38
• 3.3 重组质粒 α-Syn稳转细胞系的建立38-40
• 3.3.1 重组质粒 α-Syn稳转细胞系的筛选38-39
• 3.3.2 重组质粒Flag-Ubiquitin在稳转细胞系内的表达39-40
• 3.4 重组质粒Flag-Ubiquitin在稳转细胞内对 α-synuclein的影响40-45
• 3.4.1 B103细胞内，重组质粒Flag-Ubiquitin与 26S蛋白酶体定位结合40-41
• 3.4.2 稳转细胞内，重组质粒Flag-Ubiquitin与 26S蛋白酶体定位结合41
• 3.4.3 B103细胞内，，重组质粒Flag-Ubiquitin与内源性Ubiquitin的分布41-43
• 3.4.4 α-Syn与Ubiquitin的定位结合情况43
• 3.4.5 α-Syn与 26S蛋白酶体的定位结合情况43-45
• 3.5 SUMO在稳转细胞内对 α-Syn的影响45-50
• 3.5.1 SUMO与 α-Syn的定位结合情况45-46
• 3.5.2 在稳转细胞内，Flag-Ubiquitin与SUMO的相互作用46-50
• 4 结论50-52
• 参考文献52-58
• 致谢58-60
• 攻读学位期间发表的学术论文60-61

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