高渗盐水通过Notch信号通路减轻脑缺血炎症反应的研究

发布时间：2017-06-15 20:04

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【摘要】：缺血性脑卒中是临床上常见神经系统疾病,脑缺血灶周围的炎症因子可加重脑组织损害。这些炎症因子主要来源于小胶质细胞；激活的小胶质细胞可释放产生大量TNF-α、ROS、IL-6等炎症因子等加重脑组织损害。NF-κB信号通路是被广泛认为是调节脑缺血损伤后炎症因子释放的重要信号通路。近年来有研究表明Notch是NF-κB信号通路的上游调控点,DAPT抑制Notch信号通路可明显减少细胞核内NF-κB的分布,降低NF-κB转录活性；另一方面,激活Notch信号通路可上调NF-κB的活性。Notch信号通路在免疫细胞应答外界刺激和感染中也具有重要作用。有研究表明阻断Notch信号通路可明显减少神经元凋亡、减少激活的小胶质细胞数量,减少炎症因子IL-6、IL-1β、 M-CSF的释放以及降低脑梗死面积,提高神经行为功能。高渗盐水(HS)是指南推荐治疗脑水肿的渗透性药物,广泛应用于脑梗死、脑出血、脑外伤的患者,能有效治疗急性脑血管疾病引起的颅内高压。目前高渗盐水治疗脑损伤的渗透性机制已被广为研究,但是其非渗透性机制却越来越受关注。有研究表明高渗盐水具有神经保护作用并能降低脑梗死患者的死亡率。一些文献报道高渗盐水可以降低巨噬细胞的激活,从而减轻炎症反应。课题组前期研究表明：10%HS治疗可降低脑梗死侧脑水含量、减小脑梗死体积；并且明显减少脑梗死灶周围小胶质细胞释放炎症因子TNF-α、IL-1β。在本实验研究中,我们建立大脑中动脉栓塞的大鼠缺血性脑卒中模型,同时；采用缺氧无糖培养BV-2小胶质细胞模拟体内脑缺血损伤模型,检测缺血／缺氧损伤后Notch信号通路中Notch-1、NICD、RBP-JK、Hes-1的变化及炎症因Phos-NF-κB子iNOS、IL-1β、ROS的变化；HS对炎症因子及Notch信号通路的影响；此外,利用Notch信号通路特异性抑制剂DAPT;观察药物阻断Notch信号通路对BV-2细胞释放炎症因子的影响。探讨高渗盐水是否通过Notch信号通路抑制脑缺血后炎症因子的释放。第一章高渗盐水对脑缺血灶周围炎症因子的影响目的：建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,探索10%高渗盐水对脑缺血损伤后缺血灶周围炎症因子诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)、白介素-1β (interleukin-1 beta,IL-1β)的影响。方法：220-250g成年SPF级雄性SD大鼠,随机分为假手术组、脑缺血组、生理盐水组(简称NS组)、10%高渗盐水治疗组(简称10%HS组)。除假手术组大鼠外,其他各组大鼠采用线栓法复制右侧大脑中动脉局灶脑缺血模型,缺血2h后实施再灌注,以再灌注的时间点作为治疗起点,NS组和10%HS组按0.3 mL/h分别经尾静脉匀速泵入生理盐水和10%高渗盐水。以治疗时间分两个亚组,分别为治疗12h组和24h组；治疗12h或24 h后提取缺血侧大脑半球,免疫双荧光法检测缺血灶周围iNOS、IL-1β与小胶质细胞(Lectin标记)的共定位表达；Western Blot方法检测脑缺血再灌注损伤12h及24h后缺血灶周围大脑皮层组织中iNOS的蛋白表达水平,数据采用单因素方差分析,用LSD法进行组间两两比较,P0.05为差异具有统计学意义。结果：免疫双荧光提示假手术组小胶质细胞呈分枝状,iNOS及IL-1p几乎不表达于小胶质细胞；脑缺血损伤后,小胶质细胞被激活,细胞形态呈圆形或阿米巴形,脑缺血组与NS组iNOS及IL-1p在小胶质细胞上的表达明显增加；10%HS治疗24h后,iNOS及IL-1p在小胶质细胞上的表达明显减少。Western Blot提示：与假手术组比较,脑缺血损伤12h或24h后脑缺血组与生理盐水组脑缺血灶周围大脑皮层组织中iNOS的蛋白表达水平明显增加(*P0.05)；与脑缺血组比较,生理盐水治疗12h或24h后脑缺血灶周围皮层组织中iNOS的蛋白表达水平无明显变化(P0.05)；与脑缺血组及生理盐水组比较,10%高渗盐水治疗12h或24h后,脑缺血灶周围皮层组织中iNOS的蛋白表达水平均明显减少(#P0.05)。结论：高渗盐水能抑制脑缺血灶周围小胶质细胞的激活并抑制小胶质细胞释放炎症因子iNOS、IL-1β。第二章高渗盐水对脑缺血灶周围Notch信号通路的影响目的：建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,探索脑缺血损伤后Notch信号通路的改变及高渗盐水对脑缺血大鼠缺血灶周围Notch信号通路的影响。方法：220-250g成年SPF级雄性SD大鼠,随机分为假手术组、脑缺血组、生理盐水组(简称NS组)、10%高渗盐水治疗组(简称10%HS组)。除假手术组大鼠外,其他各组大鼠采用线栓法复制右侧大脑中动脉局灶脑缺血模型,缺血2h后实施再灌注,以再灌注的时间点作为治疗起点,生理盐水组和10%高渗盐水组按0.3 mL/h分别经尾静脉匀速泵入生理盐水和10%高渗盐水。以治疗时间分两个亚组,分别为治疗12h组和24h组；治疗12h或24h后提取缺血侧大脑半球。采用免疫双荧光法检测各组大鼠脑缺血灶周围Notch信号通路中Notch-1、 NICD、RBP-JK、Hes-1与小胶质细胞(Lectin标记)共定位表达；采用Western Blot法检测各组大鼠脑缺血灶周围皮层组织中Notch信号通路中Notch-1、NICD、 RBP-JK、Hes-1的蛋白表达情况。数据采用单因素方差分析,用LSD法进行组间两两比较,P0.05为差异具有统计学意义。结果：免疫双荧光提示假手术组小胶质细胞呈分枝状,缺血灶周围小胶质细胞几乎不表达Notch-1与NICD、RBP-JK、Hes-1;脑缺血损伤后,脑缺血灶周围小胶质细胞被激活,细胞形态呈圆形或阿米巴形,脑缺血组与NS组Notch-1与NICD、RBP-JK、 Hes-1在小胶质细胞上的表达明显增加；10%HS治疗24h后,Notch 与 NICD、RBP-JK、Hes-1在小胶质细胞上的表达明显减少。Western Blot提示：与假手术组比较,脑缺血损伤12h或24h后脑缺血组与NS组脑缺血灶周围皮层组织中Notch-1与NICD、RBP-JK、Hes-1的蛋白表达水平明显增加(*P0.05)；与脑缺血组比较,生理盐水治疗12h或24h后脑缺血灶周围皮层组织中Notch-1与NICD、RBP-JK、Hes-1的蛋白表达水平无明显变化(P0.05)；与脑缺血组及生理盐水组比较,10%高渗盐水治疗12h或24h后脑缺血灶周围皮层组织中Notch-1与NICD、RBP-JK、Hes-1的蛋白表达水平均明显减少(#P0.05)。结论：脑缺血损伤后脑缺血灶周围小胶质细胞上Notch信号通路可被激活,Notch信号通路中Notch-1与NICD、RBP-JK, Hes-1的表达明显增加；高渗盐水可抑制大鼠脑缺血后小胶质细胞上Notch信号通路的激活,减少Notch-1与NICD、 RBP-JK、Hes-1的表达。第三章高渗盐水对BV-2小胶质细胞释放炎症因子的影响及其机制研究目的：探讨80mM HS对缺氧后BV-2小胶质细胞释放炎症因子一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)、白介素-1β (interleukin-1 beta, IL-1β)、氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的影响及高渗盐水是否通过Notch信号影响炎症因子的释放。方法：采用缺氧无糖培养BV-2小胶质细胞模拟体内脑缺血再灌注损伤模型；将BV-2小胶质细胞细胞分为四组：对照组、缺氧无糖培养组、缺氧无糖培养+80mMHS组(缩写为：HS组)、缺氧无糖培养+DAPT组(缩写为：DAPT组),对照组细胞使用正常培养基在普通培养箱中持续培养,其它三组细胞药物预处理1h后,在3%O2,5%CO2,92%N2的条件下缺氧无糖培养4小时,然后所有组细胞更换成基础培养基再正常培养1h。采用免疫荧光法、Western Blot法检测缺氧后BV-2小胶质细胞Notch信号通路Notch-1与NICD、RBP-JK、Hes-1、炎症因子Phos-NF-κB、iNOS、IL-1β的表达情况；及HS对小胶质细胞中Notch信号通路Notch-1 与 NICD、RBP-JK、Hes-1、炎症因子Phos-NF-κB、iNOS、IL-1β的影响；此外,采用Notch信号通路特异性阻断剂DAPT,观察药物阻断Notch信号通路对BV-2细胞释放炎症因子Phos-NF-κB、 iNOS、IL-1β的影响；DCFH-DA法检测缺氧后BV-2细胞表达ROS的情况及DAPT阻断Notch信号通路对ROS的影响和HS对缺氧后BV-2释放ROS的影响。数据采用单因素方差分析,用LSD法进行组间两两比较,P0.05为差异具有统计学意义。结果：与对照组比较,BV-2小胶质细胞在缺氧无糖培养4小时后释放大量的炎症因子Phos-NF-κB, iNOS, IL-1β, ROS(*P0.05);与缺氧组比较,DAPT组、HS组中炎症因子Phos-NF-κB、iNOS、IL-1β、ROS的表达水平均明显减少(#P0.05)；其中,免疫荧光提示缺氧无糖培养4h后BV-2小胶质细胞的细胞核内 Phos-NF-KB的分布明显增加；DAPT、HS组BV-2小胶质细胞的细胞核内Phos-NF-κB分布明显减少。与对照组比较,BV-2小胶质细胞在缺氧无糖培养4小时后Notch-1与NICD、RBP-JK、Hes-1表达水平均明显增加(*P0.05),与缺氧组比较,DAPT组、HS组中NICD、RBP-JK、Hes-1的表达水平均明显减少(#P0.05)。结论：缺氧可激活BV-2小胶质细胞并释放大量炎症因子Phos-NF-κB、iNOS、 IL-1β, ROS,同时也激活BV-2小胶质细胞Notch信号通路,Notch-1与NICD、 RBP-JK、Hes-1表达均明显增加；HS可抑制BV-2小胶质细胞释放炎症因子及其Notch信号通路的激活；药物阻断Notch信号通路的激活可抑制BV-2小胶质细胞释放炎症因子Phos-NF-κB、 iNOS, IL-1β, ROS。提示Notch信号通路可调控NF-κB信号通路。HS可能通过抑制Notch信号通路的激活进而抑制Phos-NF-κB的核转移,从而抑制BV-2小胶质细胞释放炎症因子。
【关键词】：脑缺血 高渗盐水 Notch信号通路 缺氧无糖培养 小胶质细胞 NF-κB信号通路 炎症因子
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-20
• 第一章 高渗盐水对脑缺血灶周围炎症因子的影响20-34
• 1 实验目的20
• 2 实验动物及材料20-23
• 2.1 实验动物20
• 2.2 实验材料20-22
• 2.3 试剂准备22-23
• 3 实验方法23-28
• 3.1 实验动物分组23
• 3.2 大鼠大脑中动脉局灶脑缺血再灌注模型制作23-24
• 3.3 免疫双荧光法检测10%HS对脑缺血灶周围小胶质细胞释放炎症因子的影响24-25
• 3.4 Western Blot法检测10%HS对脑缺血灶周围iNOS蛋白水平的影响25-28
• 3.5 统计方法28
• 4 实验结果28-31
• 4.1 10%HS对脑缺血灶周围小胶质细胞释放炎症因子的影响28-30
• 4.2 10%HS对脑缺血灶周围iNOS蛋白水平的影响30-31
• 5 实验讨论31-33
• 6 实验结论33-34
• 第二章 高渗盐水对脑缺血灶周围Notch信号通路的影响34-46
• 1 实验目的34
• 2 实验动物及材料34-35
• 2.1 实验动物34
• 2.2 实验材料34-35
• 2.3 试剂准备35
• 3 实验方法35-37
• 3.1 实验动物分组35-36
• 3.2 大鼠大脑中动脉局灶脑缺血再灌注模型制作36
• 3.3 免疫双荧光法检测10%HS对脑缺血灶周围Notch信号通路的影响36
• 3.4 Western Blot法检测10%HS对脑缺血灶周围Notch信号通路蛋白水平影响36-37
• 3.5 统计方法37
• 4 实验结果37-44
• 4.1 10%HS对脑缺血灶周围小胶质细胞Notch信号通路的影响37-41
• 4.2 10%HS对脑缺血灶周围Notch信号通路蛋白水平影响41-44
• 5 实验讨论44-45
• 6 实验结论45-46
• 第三章 高渗盐水对BV-2小胶质细胞释放炎症因子的影响及其机制研究46-72
• 1 实验目的46
• 2 实验细胞及材料46-49
• 2.1 实验细胞46
• 2.2 实验材料46-48
• 2.3 试剂准备48-49
• 3 实验方法49-56
• 3.1 实验细胞分组49-50
• 3.2 BV-2小胶质细胞培养50
• 3.3 BV-2小胶质细胞的鉴定50
• 3.4 CCK8检测不同浓度HS对BV-2小胶质细胞的影响50-51
• 3.5 CCK8检测10μM DAPT对BV-2小胶质细胞的影响51
• 3.6 免疫荧光法检测HS及DAPT对BV-2小胶质细胞释放炎症因子Phos-NF-κB、iNOS、IL-1β的影响51-52
• 3.7 DCFH-DA法检测HS及DAPT对小胶质细胞释放ROS的影响52-53
• 3.8 Western Blot法检测HS及DAPT对BV-2小胶质细胞中炎症因子iNOS、Phos-NF-κB、IL-1β蛋白水平的影响53-55
• 3.9 免疫荧光法检测HS及DAPT对BV-2小胶质细胞Notch信号通路的影响55
• 3.10 Western Blot法检测HS及DAPT对BV-2小胶质细胞Notch信号通路蛋白水平的影响55
• 3.11 统计方法55-56
• 4 实验结果56-69
• 4.1 BV-2小胶质细胞的鉴定56
• 4.2 不同浓度HS对BV-2小胶质细胞的影响56-57
• 4.3 10μM DAPT对BV-2小胶质细胞的影响57-58
• 4.4 HS及DAPT对BV-2小胶质细胞释放炎症因子的影响58-61
• 4.5 HS及DAPT对小胶质细胞释放ROS的影响61-62
• 4.6 HS及DAPT对BV-2小胶质细胞中炎症因子Phos-NF-κB、iNOS、IL-1β蛋白水平的影响62-63
• 4.7 HS及DAPT对BV-2小胶质细胞Notch信号通路的影响63-67
• 4.8 HS及DAPT对BV-2小胶质细胞Notch信号通路蛋白水平的影响67-69
• 5 实验讨论69-71
• 6 实验结论71-72
• 全文总结72-73
• 参考文献73-76
• 附录：Notch信号通路与中枢神经系统（综述）76-83
• 参考文献81-83
• 攻读学位期间发表的论文83-84
• 致谢84-85

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