蛋白质4.1R与重症肌无力关系的探讨

发布时间：2017-06-27 12:04

  本文关键词：蛋白质4.1R与重症肌无力关系的探讨，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景重症肌无力(Myasthenia gravis,MG)是神经系统的自身免疫性疾病(Autoimmune disease,AID),也是目前抗原最为明确的AID。迄今为止发病机制还不明了,缺乏特效的治疗方案,目前多以口服药物、免疫抑制剂注射及胸腺切除术等治疗手段较常见。课题组前期利用蛋白质组学方法从重症肌无力(MG)伴胸腺异常的病人胸腺组织中筛选出差异蛋白4.1R。4.1R(EPB41)是蛋白质4.1家族的成员之一,它是细胞骨架蛋白,在细胞膜、细胞质及细胞核中均有表达。它参与细胞增殖分裂的调控,且其表达异常会影响细胞的极性及细胞的迁移等。它与其他细胞膜骨架蛋白,肌肉收缩相关蛋白等均有相互作用,可引起如贫血、肌肉收缩障碍等疾病。同时与离子交换蛋白及细胞膜钙泵蛋白等相互作用,可以调节离子转运及钙离子的吸收等功能。蛋白质4.1R在多种肿瘤疾病中都有研究,且发现蛋白质4.1R是肿瘤的负调控分子。蛋白质4.1R对T细胞的活化有负调控作用,而T细胞的活化异常可导致AID的发生。与很多疾病的发生都相关,但目前4.1R在AID中的研究较少,在MG中的研究更少。本课题主要以重症肌无力两个典型的临床症状“自身免疫”和“肌无力”为主线,探讨蛋白4.1R在MG中的作用机制。将对MG的发病机制和MG的治疗提供更进一步的认识和帮助。目的以“自身免疫”为主线利用4.1R对DC细胞的生物功能影响来探讨蛋白质4.1R在重症肌无力中的作用机制。另外以“肌无力”为主线利用4.1R在膈肌无力模型中的表达及意义来反映蛋白质4.1R在MG中的作用机制。方法将基因4.1R的CDS区全长片段与pCMV-C-Flag和pEGFP-N2载体重组,构建过表达质粒4.1R-Flag和4.1R-GFP,然后将它们转到DC细胞中,加G418筛选,得到稳定株DC-Flag、DC-4.1R-Flag(DC-4.1R-Flag)、DC-GFP、DC-4.1R-GFP(DC-4.1R-Flag);将空病毒RNAi-Control及经慢病毒转染包装的sh-4.1R转入DC细胞,筛选得到空病毒的稳定株iidc-rnai-control(对照nc)和dc-4.1r-rnai(dc-sh-4.1r)。用rt-pcr和wb方法验证dc-4.1r-flag、dc-4.1r-gfp、dc-sh-4.1r在mrna及蛋白水平的表达。然后用流式细胞术检测dc-4.1r-flag、dc-sh-4.1r及其相应对照组稳定株的表面分子mhcii及共刺激分子cd80、cd86的表达。用细胞划痕和transwell小室实验来研究基因4.1r过表达与沉默后dc细胞迁移的改变。然后,用rt-pcr和免疫印迹杂交方法及免疫组化方法检测4.1r在感染致膈肌无力模型中的变化。用免疫印迹杂交方法和细胞免疫组化方法验证4.1r基因敲低后c2c12细胞中肌肉型乙酰胆碱受体的变化。结果1、成功构建4.1r-flag及4.1r-egfp过表达质粒。2、成功筛选得到过表达稳定株dc-flag(对照组)、dc-4.1r-flag、dc-egfp(对照组)、dc-4.1r-egfp;沉默稳定株dc-rnai-control(对照组nc)和dc-sh-4.1r稳定株。3、dc-4.1r-flag稳定株与对照组相比体积变大,突触减少;dc-sh-4.1r稳定株与对照组相比体积变小,突触变的较细且多。4、经流式检测,dc-4.1r-flag稳定株与对照组相比表面分子mhcii和共刺激分子cd80、cd86的表达量降低(p0.05);而dc-sh-4.1r稳定株与对照组相比表面共刺激分子cd80、cd86的表达量升高(p0.05),但表面分子mhcii变化不明显。5、经细胞迁移实验(细胞划痕和transwell小室实验)发现dc-4.1r-flag稳定株与对照组相比迁移能力变强(p0.05),而dc-sh-4.1r稳定株与对照组相比迁移能力下降(p0.05)。6、用rt-pcr及wb、免疫组化实验证明4.1r在膈肌无力模型中mrna水平及蛋白水平表达量与其对照组相比均增高。7、通过在感染致膈肌无力模型及c2c12细胞中检测蛋白质4.1r及各肌肉收缩蛋白发现,蛋白质4.1r可以调节肌间、肌球蛋白的变化。8、经wb与细胞免疫组化验证在c2c12细胞中沉默基因4.1r发现肌肉型achr的阳性颗粒比对照组多且着色深,两者存在负相关性。结论1、4.1r可以影响dc细胞的形态、抗原递呈能力及迁移能力。2、4.1R与肌无力发生相关,与乙酰胆碱受体在肌肉细胞中的表达成负相关。所以无论从自身免疫还是肌无力角度来探讨,4.1R都参与了MG的发生,是MG的重要分子。
【关键词】：4.1R 重症肌无力 DC细胞 膈肌无力 乙酰胆碱受体
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R746.1
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 缩略词表13-15
• 引言15-17
• 第一部分 探讨 4.1R对DC细胞生物功能的影响17-45
• 1.1 前言17
• 1.2 材料17-23
• 1.2.1 主要试剂17-19
• 1.2.2 仪器设备19-20
• 1.2.3 主要溶剂的配制20-23
• 1.3 方法23-32
• 1.3.1 引物设计23
• 1.3.2 基因 4.1R过表达载体的构建23-27
• 1.3.4 细胞培养和转染27
• 1.3.5 mRNA的提取及逆转录反应27-28
• 1.3.6 荧光定量PCR28-29
• 1.3.7 蛋白质的提取和BCA法测定蛋白浓度29
• 1.3.8 免疫印迹杂交法29-31
• 1.3.9 细胞膜表面表达分子及表面共刺激的分子的检测（直接标记法）31
• 1.3.10 细胞划痕实验31
• 1.3.11 细胞小室实验31-32
• 1.3.12 统计学分析32
• 1.4 结果32-41
• 1.4.1 成功构建 4.1R-Flag与 4.1R-EGFP过表达质粒32-33
• 1.4.2 成功构建 4.1R过表达及沉默稳定株（RT-PCR验证）33-34
• 1.4.3 成功构建 4.1R过表达及沉默稳定株（WB验证）34-35
• 1.4.4 基因 4.1R过表达与沉默对DC细胞形态的影响35-36
• 1.4.5 基因 4.1R过表达与沉默对DC表面分子MHCII及表面共刺激分子CD80、CD86的影响36-39
• 1.4.6 基因 4.1R过表达与沉默对DC细胞迁移的影响（细胞划痕实验）39
• 1.4.7 基因 4.1R过表达与沉默对DC细胞迁移的影响（Transwell实验）39-41
• 讨论41-43
• 小结43-45
• 第二部分 探讨 4.1R在感染致膈肌无力模型中的表达及意义45-57
• 2.1 前言45
• 2.2 材料及试剂45-46
• 2.2.1 主要材料和试剂45-46
• 2.2.2 仪器设备46
• 2.2.3 主要溶液的配制46
• 2.3 方法46-48
• 2.3.1 RT-PCR引物的设计与合成46
• 2.3.2 mRNA的提取及反转录成cDNA46
• 2.3.3 蛋白的提取及BCA测蛋白浓度46
• 2.3.4 免疫印迹杂交46
• 2.3.5 免疫组织化学染色46-47
• 2.3.6 细胞免疫组化(DAB显色)47
• 2.3.7 统计学分析方法47-48
• 2.4 结果48-53
• 2.4.1 4.1R在膈肌无力模型中mRNA水平的表达48
• 2.4.2 蛋白质 4.1R在膈肌无力模型中的表达48-49
• 2.4.3 蛋白质 4.1R明显促进了肌肉收缩蛋白的表达49-50
• 2.4.5 沉默 4.1R后肌肉乙酰胆碱受体在C2C12细胞的表达50-53
• 讨论53-55
• 小结55-57
• 总结57-59
• 参考文献59-61
• 综述61-73
• 参考文献67-73
• 致谢73-75
• 在读期间参加的学术会议及研究成果75-76

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