激活TRPV4受体对海马神经元存活的作用及其分子机制研究

发布时间：2017-06-30 08:07

  本文关键词：激活TRPV4受体对海马神经元存活的作用及其分子机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景瞬时感受器电位香草素受体亚家族IV型(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是瞬时感受器电位受体家族成员之一。该受体广泛分布在中枢神经系统中,在海马、大脑皮层、丘脑、小脑等脑区均有较多表达。TRPV4受体是一种“多觉型”受体,可以被多种因素如细胞水肿、温热刺激、花生四烯酸及其代谢产物等激活,该受体激活后引起以钙离子为主的阳离子内流,导致细胞内游离钙离子浓度升高。资料报道,给予TRPV4受体激动剂可以剂量依赖性地引起视网膜节细胞死亡,并介导次声所致的神经元损伤。但是TRPV4受体引起细胞死亡的机制目前尚不清楚。脑缺血时由于能量代谢障碍可以导致细胞毒性水肿和细胞膜脂质代谢障碍,而这些病理改变均可以激活TRPV4受体。我们前期的研究发现,脑缺血再灌注过程中,TRPV4受体蛋白表达增加,给予TRPV4受体阻断剂可以明显减少脑梗死体积。离体实验也证明阻断TRPV4受体可以减轻氧化应激对海马星形胶质细胞的损伤,对氧糖剥夺导致的海马CA1神经元损伤也具有保护作用。以上报导提示TRPV4受体是介导缺血性脑损伤的一个重要靶点。丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)信号通路是控制细胞的增殖、分化、存活和死亡的重要胞内信号通路之一;而磷酸肌醇激酶3(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路是一个经典的抗凋亡、促进细胞存活的信号转导通路。脑缺血时,MAPK信号通路被过度激活,而Akt信号通路被抑制是介导神经损伤的重要原因。在培养的脂肪细胞上,TRPV4受体激动剂可以增加细胞外调节蛋白激酶ERK(extracellular regulated protein kinases,ERK)和C-氨基末端激酶(c-Jun N-terminal protein kinase,JNK)的磷酸化水平。在血管内皮细胞上,激活TRPV4受体后可以激活PI3K。在多囊肾大鼠的胆管上皮细胞上,给予TRPV4受体激动剂可以增加Akt磷酸化水平,降低ERK磷酸化水平。以上资料提示激活TRPV4受体可以调节MAPK和PI3K/Akt信号通路。我们前期的研究发现给予TRPV4激动剂对N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)介导的电流具有增强作用,提示激活TRPV4受体可以增强NMDA受体的功能。基于上述报道和前期的研究,本课题提出激活TRPV4受体通过调节NMDA受体及其下游的MAPK或PI3K/Akt信号通路介导细胞损伤,参与缺血性脑损伤的过程,为临床治疗缺血性脑损伤提供新靶点和理论依据。研究目的1.明确激活TRPV4受体对海马神经元存活的作用及其机制。2.阐明TRPV4受体介导缺血性脑损伤的机制。第一部分激活TRPV4受体对海马神经元存活的作用及其机制材料与方法1.制备激活TRPV4受体的在体模型:侧脑室注射不同浓度剂量的TRPV4受体激动剂GSK1016790A,制备激活TRPV4受体的在体模型。2.组织化学染色:脑组织固定后石蜡包埋切片,用甲苯胺蓝染色观察GSK1016790A对海马CA1和CA2/3区神经元存活的作用。3.蛋白印迹(Western blot):检测GSK1016790A对海马组织目标蛋白表达的作用。结果1.侧脑室注射GSK1016790A在(0.1~5μM/小鼠)浓度范围内能剂量依赖性地导致海马CA1区和CA2/3区神经元死亡。2.给予GSK1016790A能增加NMDA受体NR2B亚基磷酸化水平。3.给予GSK1016790A能增加ERK的磷酸化(phosphorylation of ERK,pERK)水平,并降低Akt的磷酸化(phosphorylation of Akt,p-Akt)水平;给予NR2B亚基受体的阻断剂Ro25-6981能有效阻断GSK1016790A对pERK和p-Akt的调节作用。4.给予NR2B的阻断剂Ro25-6981或PI3K的激动剂740 Y-P能有效阻断GSK1016790A的神经毒性作用,但是给予MAPK激酶(mitogen-activated protein kinase/ERK kinase,MEK)的阻断剂U0126不能阻断GSK1016790A所致的神经毒性作用。结论激活TRPV4受体通过磷酸化NMDA受体的NR2B亚基,下调Akt信号通路,进而导致神经损伤作用。第二部分TRPV4受体介导缺血性脑损伤的机制材料与方法1.脑缺血再灌注模型制备:运用血管内线栓法阻塞右侧大脑中动脉60 min,制备大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)的小鼠模型。2.脑梗死体积测定:MCAO再灌注后24 h和48 h的脑片置于氯化三苯基四氮唑(tetrazolium chloride,TTC)溶液中反应,正常脑组织呈红色,而梗死组织呈白色,白色脑组织体积即为MCAO后脑梗死体积。3.Hoechst染色:MCAO再灌注48 h的脑片进行Hoechst染色以观察海马神经元的凋亡。4.蛋白印迹(Western blot):检测MCAO再灌注不同时间点海马组织目标蛋白表达水平。结果1.脑缺血再灌注1~24 h内p-ERK蛋白水平增高,p-ERK蛋白增加程度随着再灌注时间的延长逐渐下降。2.脑缺血再灌注1~24 h内p-Akt蛋白水平在再灌注1~4 h内增加,随着再灌注时间的延长,p-Akt水平明显下降。3.侧脑室注射TRPV4受体阻断剂HC-067047(10μM/鼠)能有效减小MCAO再灌注24 h和48 h脑梗死体积,并能有效降低p-ERK蛋白水平、增加pAkt蛋白水平。4.侧脑室注射TRPV4受体阻断剂HC-067047(10μM/鼠)能有效抑制MCAO再灌注48 h海马CA1区的细胞凋亡,提高Bcl-2/Bax蛋白比值,抑制caspse-3剪切体蛋白水平。5.侧脑室注射TRPV4受体激动剂GSK1016790A能降低Bcl-2/Bax蛋白比值,增加caspse-3剪切体蛋白水平,给予PI3K激动剂740 Y-P能有效阻断GSK1016790A的上述作用。结论综合本课题实验结果和课题组前期的研究,在脑缺血时,TRPV4受体被过度激活,通过增强NMDA受体NR2B亚基的功能下调Akt信号通路,进而降低Bcl-2/Bax蛋白比值,激活caspase-3,导致细胞凋亡和神经损伤,这是TRPV4受体介导脑缺血时神经损伤的重要机制之一。
【关键词】：瞬时感受器电位香草素受体亚家族IV型 神经毒性作用 NMDA受体 ERK信号通路 Akt信号通路 瞬时感受器电位香草素受体亚家族IV型 脑缺血 凋亡 ERK信号通路 Akt信号通路
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 中文摘要5-10
• Abstract10-15
• 第一部分 激活TRPV4受体对海马神经元存活的作用 及其机制15-33
• 前言15-17
• 材料和方法17-23
• 实验结果23-28
• 讨论28-29
• 小结29-30
• 参考文献30-33
• 第二部分TRPV4受体介导缺血性脑损伤的机制33-55
• 前言33-35
• 材料和方法35-42
• 实验结果42-49
• 讨论49-51
• 小结51-52
• 参考文献52-55
• 综述55-69
• 参考文献64-69
• 攻读学位期间发表文章情况69
• 攻读学位期间发表会议论文69-70
• 致谢70

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本文编号：501157