室管膜下区神经干细胞增殖和迁移的影响因素及机制研究

发布时间：2017-07-03 13:20

  本文关键词：室管膜下区神经干细胞增殖和迁移的影响因素及机制研究

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【摘要】：位于侧脑室壁SVZ的神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)具有自我更新、增殖、干性维持、迁移和分化为神经系统主要神经细胞亚群的潜能。近年来研究证实SVZ的NSCs可在脑损伤(如:脑缺血、脑出血、脑外伤)后,发生原位激活,增殖、迁移,并在损伤灶处分化为功能神经元,整合于受损的神经网络发挥相应的神经功能。尽管研究证实了其在脑组织损伤后的功能,但脑组织受损后SVZ神经干细胞的增殖和向损伤灶迁移能力有限,影响脑损伤后的功能康复。因此,针对SVZ神经干细胞这一特殊的细胞群体,研究增强其增殖和迁移能力的药物及潜在机制具有重大的基础研究和临床意义。组织p H值是神经细胞发挥功能的重要微环境参数,病理条件下如脑缺血后可引起大量酸性物质的堆积,使得缺血核心区周围组织p H可下降至6.5,严重时6.0以下,它的变化必然会影响SVZ神经干细胞功能,因此我们推测微环境酸化对SVZ神经干细胞的迁移会产生抑制作用。同时,青蒿琥酯(Artesunate)具有高效、低毒、易通过血脑屏障的特性,在临床中被广泛用于疟疾的治疗,近年来研究表明其也有抗肿瘤的作用。但其对SVZ区神经干细胞的增殖作用未见相关研究,我们推测适当浓度的ART可促进SVZ神经干细胞的增殖。为验证以上两种推测的正确性,本研究以SVZ神经干细胞为切入点,结合离体和在体实验,综合应用免疫荧光、激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)、药理学、生化与分子生物学等方法,阐述ART对SVZ神经干细胞增殖的促进作用及ASIC1a对SVZ神经干细胞迁移的抑制作用及可能机制。具体研究内容如下:一、酸敏感离子通道1a对SVZ区神经干细胞迁移中的作用及机制研究目的通过体外培养SVZ神经干细胞,采用免疫荧光方法检测酸敏感离子通道1a(acid-sensing ion channels 1a,ASIC1a)蛋白在NSCs的表达;建立不同酸化梯度环境,研究其对NSCs迁移的影响;并采用Pc TX1研究酸敏感离子通道对NSCs迁移影响的可能机制。方法通过体外培养SVZ神经干细胞,以PO包被后,分别将神经干细胞球(neurosp Here)置于以下各组:对照组(p H 7.4)、p H 6.0组p H 6.5组、p H 6.8组、p H 7.0组、p H 7.2组,24h后以倒置相差显微镜观察各组迁出的细胞数目及迁行距离,筛选对迁移影响最明显的p H值;以CCK8法检测各组之间p H对神经干细胞球活性的影响;免疫荧光法行Nestin和ASIC1a之间的双标、RT-PCR及WB确认ASIC1a在NSCs上的表达;设置对照组(p H7.4)、p H 6.8组、p H 6.8+Pc TX1组,分别在24h以倒置相差显微镜和Transwell法观察ASIC1a对神经干细胞迁移的影响,并以WB检测各组之间ASIC1a蛋白表达水平的差异;实验动物以同样的分组,在纹状体区分别注入20μl各p H值的生理盐水,动物造模成功后腹腔内注射Brdu(50mg/Kg),并于3天时将动物处死,以Brdu+Nestin免疫荧光双染,观察SVZ向酸化灶处迁移的细胞数目和距离。通过体内外实验验证ASIC1a对神经干细胞迁移的影响。结果1.在p H 6.0和p H 6.5的酸性环境中,神经干细胞的活性与对照组相比受到明显影响;2.在p H 6.8的酸性环境中,神经干细胞的活性未见明显影响,但神经干细胞从细胞球向外迁出的数量和距离明显减少和缩短;3.ASIC1a+与nestin+的神经干细胞共标,且通过RT-PCR和WB分别检测了m RNA和蛋白的表达,即:ASIC1a在NSCs上表达;4.p H 6.8酸性环境中NSCs的迁移受到抑制,ASIC1a在该效应中起重要作用;Pc TX1可减弱该现象;5.p H 6.8组的微环境酸化迁移模型中SVZ向酸化灶处迁移的Brdu+细胞数目明显减少,当应用Pc TX1后,该现象减弱。结论ASIC1a在NSCs上的表达;神经干细胞在p H 6.8的酸性环境中迁移能力受到明显抑制;ASIC1a与酸性环境中NSCs迁移能力受到抑制相关,Pc TX1可减弱酸性环境中抑制NSCs迁移的现象。二、青蒿琥酯调控AKT促进大鼠SVZ神经干细胞增殖的体外研究目的 通过体外培养SVZ神经干细胞,采用CCK8及Ki-67免疫荧光方法检测不同浓度青蒿琥酯对NSCs增殖的影响,并利用PI3K-AKT通路阻断剂(LY294002)干预后,采用WB方法评估该通路在ART促进NSCs增殖中的潜在作用和机制。方法设置不同浓度的ART分组:400 nmol/L组、800 nmol/L组、1.6μmol/L组、3.2μmol/L组,作用于体外培养的NSCs 24h后,利用CCK8试剂孵育2.5h后利用多功能酶标仪在波长450nm处测定光密度值[D(450)],并于促增殖作用最明显的ART浓度组加入10μmol/L LY294002,再次采用CCK8法检测LY294002对NSCs增殖的影响。设置如下4组:Ctrl(DMSO)、LY294002组、800 nmol/L ART组、800 nmol/L ART+LY294002组,待细胞培养24h后,采用Ki-67免疫荧光双标研究PI3K-AKT通路在其中的作用,同时采用WB方法检测各组Nestin、AKT及p-AKT蛋白表达量的变化。结果1.CCK8检测结果显示在450nm处光密度值800 nmol/L ART组较空白对照组明显升高(P0.05),在加入10μmol/L LY294002后,其光密度值明显下降,与空白对照组水平相当;2.Ki-67免疫荧光双标结果显示:800 nmol/L ART可明显促进NSCs增殖,10μmol/L LY294002可抑制这一作用;3.WB结果显示:Nestin及p-AKT蛋白表达水平在800 nmol/L ART组明显上调,在加入10μmol/L LY294002后两者表达水平均下调(P0.05)。结论800 nmol/L ART在体外可促进SVZ分离培养的NSCs的增殖,其机制与PI3K-AKT信号通路相关。
【关键词】：神经干细胞 酸敏感离子通道1a SVZ 迁移 PcTX1 神经干细胞 青蒿琥酯 PI3K-AKT 信号通路 SVZ
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 缩略语表4-5
• Abstract5-9
• 摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 酸敏感离子通道 1a在内源性神经干细胞迁移中的作用及机制研究15-34
• 2.1 材料与方法16-25
• 2.2 结果25-29
• 2.3 讨论29-32
• 2.4 小结32-34
• 第三章 青蒿琥酯调控AKT促进大鼠室管膜下区神经干细胞增殖的体外研究34-47
• 3.1 材料与方法35-40
• 3.2 结果40-43
• 3.3 讨论43-46
• 3.4 小结46-47
• 全文总结47-48
• 参考文献48-54
• 文献综述54-76
• 参考文献67-76
• 学习期间发表和待发表的论文76-77
• 致谢77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 ;Proton production,regulation and pathophysiological roles in the mammalian brain[J];Neuroscience Bulletin;2012年01期

  本文关键词：室管膜下区神经干细胞增殖和迁移的影响因素及机制研究

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本文编号：513827