miR-98通过IKKε调控NF-κB通路在胶质瘤侵袭中的作用及机制研究

发布时间：2017-07-04 01:06

  本文关键词：miR-98通过IKKε调控NF-κB通路在胶质瘤侵袭中的作用及机制研究

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【摘要】：目的本研究以不同病理级别的胶质瘤组织和U87、U251脑胶质瘤细胞为实验对象,检测miR-98与IKKε在脑胶质瘤组织及细胞中的表达及其相关性,进一步探讨miR-98介导IKKε/NF-κB通路的调控机制及与脑胶质瘤侵袭性生物学行为的关系,以期为胶质瘤的防治提供新的思路。方法1.第一步通过Real-Time PCR、Western blot方法检测53例脑胶质瘤标本、10例正常脑组织标本及胶质瘤细胞中的miR-98与IKKε、NF-κB p65的表达水平,初步探究分析miR-98与IKKε、NF-κB在脑胶质瘤组织中表达的相关性。2.第二步采用荧光素酶实验:检测miR-98与IKKε之间的调控关系。3.第三步研究人脑胶质瘤细胞转染miR-98 mimics后对胶质瘤细胞侵袭的影响及IKKε/NF-κB表达的体外研究,并初步探讨其潜在机制。a.采用miR-98 mimics转染U87及U251胶质瘤细胞,采用Real time PCR检测miR-98及IKKε、MMP-9 m RNA的表达,采用Western blot检测IKKε、细胞总NF-κB p65及细胞核中NF-κB p65、MMP-9蛋白表达;b.Transwell实验检测转染miR-98 mimics后侵袭能力的改变,划痕实验评价转染miR-98 mimics后细胞迁移能力的改变。4.第四步研究在脑胶质瘤中IKKε及NF-κB p65在miR-98调控中的作用的体外研究,并进一步验证其机制a.pc DNA3/IKKε及miR-98 mimics共转染U87及U251胶质瘤细胞,Western blot检测IKKε、MMP-9、细胞核中NF-κB p65蛋白的表达情况。采用Real time PCR检测IKKε、MMP-9 m RNA的表达;b.Transwell实验检测转染后细胞侵袭能力的改变,细胞划痕实验检测转染后细胞迁移能力的改变。c.pc DNA3/NF-κB p65及miR-98 mimics共转染U87及U251胶质瘤细胞,Western blot检测细胞核中NF-κB p65蛋白的表达情况;Transwell实验检测转染后细胞侵袭能力的改变,细胞划痕实验检测转染后细胞迁移能力的改变。结果1、脑胶质瘤中miR-98、IKKε、NF-κB p65的表达相关性a.miR-98表达水平与脑胶质瘤组织病理级别呈负相关;IKKε、NF-κB P65表达水平与脑胶质瘤组织病理级别呈正相关。b.miR-98与IKKε表达水平呈密切负相关(r2=0.7223,p0.05),miR-98与NF-κB P65表达水平呈密切负相关(r2=0.6337,p0.05);NF-κB P65与IKKε表达水平呈密切正相关(r2=0.6123,p0.05)2、U251、U87细胞较HEB细胞miR-98表达下降,IKKε表达增高;荧光素酶实验显示:转染miR-98 mimics后,IKKε-WT报告载体的荧光强度受到显著抑制;而IKKε-MUT报告载体的荧光强度基本不变,说明IKKεm RNA的3’UTR上存在miR-98的结合位点,证实IKKε是miR-98下游靶基因。3、转染miR-98 mimics发现:a.上调miR-98能够有效抑制脑胶质瘤侵袭与迁移能力。b.上调miR-98表达能够下调IKKε的表达水平及抑制NF-κB p65从细胞质到细胞核的转座,从而调控NF-κB通路及抑制MMP-9的表达水平,而不影响NF-κB p65在细胞中的总含量。4、转染pc DNA3/IKKε及miR-98 mimics发现:a.上调IKKε能够恢复因转染miR-98 mimics而降低的脑胶质瘤侵袭与迁移能力;b.上调IKKε能恢复NF-κB p65的转座从而调控NF-κB通路及恢复MMP-9的表达水平。5、转染IKKεsi RNA+miR-98 mimics与IKKεsi RNA+miR-98 inhibitor发现:抑制IKKε表达后miR-98 mimics及miR-98 inhibitor对NF-κB p65的转座及MMP-9的表达无差别。6、转染pc DNA3/NF-κB p65及miR-98 mimics发现:上调NF-κB p65能够恢复因转染miR-98 mimics而降低的脑胶质瘤侵袭与迁移能力结论miR-98可以通过IKKε基因调控NF-κB通路,影响脑胶质瘤细胞的侵袭、迁移能力。miR-98在胶质瘤中作为一个抑癌基因并可做为潜在治疗脑胶质瘤的分子靶点。
【关键词】：miR-98 IKKε NF-κB p65 人脑胶质瘤
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文缩略词表10-11
• 第1章 前言11-13
• 第2章 材料与方法13-23
• 2.1 材料13-16
• 2.1.1 脑胶质瘤标本来源13-14
• 2.1.2 胶质瘤细胞系14
• 2.1.3 细胞培养试剂14
• 2.1.4 Real tine PCR相关试剂及材料14
• 2.1.5 Western blot相关试剂及材料14-15
• 2.1.6 细胞转染相关试剂及材料15
• 2.1.7 细胞迁移、侵袭相关试剂及材料15
• 2.1.8 主要仪器和设备15-16
• 2.2 实验方法16-23
• 2.2.1 细胞培养、传代、冻存和复苏16
• 2.2.2 实时荧光定量-PCR检测脑胶质瘤组织及细胞中miR-98、IKKεm RNA等的表达水平16-18
• 2.2.3 Western blot法检测脑胶质瘤细胞及组织中蛋白的表达水平18-21
• 2.2.4 荧光素酶基因报告实验21
• 2.2.5 细胞转染21-22
• 2.2.6 划痕法迁移实验22
• 2.2.7 Transwell体外侵袭实验22
• 2.2.8 统计学分析22-23
• 第3章 结果23-38
• 3.1 miR-98、IKKε、NF-κB p65在脑胶质瘤中的异常表达及相关性23-28
• 3.1.1 荧光定量PCR检测miR-98 在脑胶质瘤中的表达水平23
• 3.1.2 Western blot检测IKKε、NF-κB p65在脑胶质瘤中的表达水平23-24
• 3.1.3 miR-98、IKKε、NF-κB p65三者间表达水平的相关性分析24-26
• 3.1.4 Real time PCR检测miR-98、IKKε在脑胶质瘤细胞的表达26-27
• 3.1.5 荧光素酶报告实验结果27-28
• 3.2 miR-98 对人脑胶质瘤细胞侵袭及IKKε/NF-κB通路影响的体外研究28-32
• 3.2.1 miR-98 mimics能有效上调脑胶质瘤细胞中miR-98 的表达28
• 3.2.2 miR-98 mimics能有效抑制脑胶质瘤细胞的侵袭能力28-29
• 3.2.3 miR-98 mimics能有效抑制脑胶质瘤细胞的迁移能力29-30
• 3.2.4 Western blot检测miR-98 mimics转染后胶质细胞瘤中相关蛋白的变化30-31
• 3.2.5 Real time PCR检测miR-98 mimics转染后胶质细胞瘤中相关基因m RNA的变化31-32
• 3.3 IKKε在miR-98 调控NF-κB通路中的作用的体外研究32-37
• 3.3.1 IKKε能有效恢复因miR-98 抑制的脑胶质瘤细胞的侵袭能力32-33
• 3.3.2 IKKε能有效恢复因miR-98 抑制的脑胶质瘤细胞的迁移能力33-34
• 3.3.3 Western blot检测IKKε转染后胶质细胞瘤中相关蛋白的变化34-35
• 3.3.4 Real time PCR检测IKKε转染后胶质细胞瘤中相关基因m RNA的变化35
• 3.3.5 Western blot 检测抑制 IKKε表达后转染 mi R-98 mimics/ inhibitor 对下游相关蛋白的影响35-37
• 3.4 NF-κB在miR-98 调控IKKε中作用的体外研究37-38
• 3.4.1 NF-κB p65能有效恢复因miR-98 抑制的脑胶质瘤细胞的侵袭、迁移能力37-38
• 第4章 讨论38-42
• 第5章 结论与展望42-43
• 5.1 结论42
• 5.2 展望42-43
• 致谢43-44
• 参考文献44-46
• 发表论文和参加科研情况说明46-47
• 综述47-54
• 参考文献52-54

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