远程缺血后处理通过Nrf2-ARE通路减轻大鼠慢性脑缺血损伤的机制研究

发布时间：2017-07-04 20:23

  本文关键词：远程缺血后处理通过Nrf2-ARE通路减轻大鼠慢性脑缺血损伤的机制研究

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【摘要】：目的采用双侧颈总动脉永久结扎改良法(permanent bilateral common carotid artery occlusion,BCAO建立慢性脑缺血动物模型,证实远程缺血后处理对慢性脑缺血大鼠的神经保护作用,进一步明确其保护机制是否与激活Nrf2-ARE信号通路,降低Tau蛋白磷酸化水平,减少神经元胞质内Tau蛋白异常积聚有关。方法(1)健康成年SD大鼠,随机分为四组分别为假手术组(Sham,n=20)、双侧颈总动脉永久结扎模型组(BCAO,n=20)、肢体远程缺血后处理3天组(RIPC3d,n=20)和肢体远程缺血4周组(RIPC4W,n=20)。采用永久双侧颈总动脉结扎改良法(BCAO)制备慢性脑缺血模型,先结扎一侧颈总动脉,3天后,再结扎另一侧颈总动脉,术后立即实施远程缺血后处理即用橡皮筋结扎大鼠的双下肢,结扎10分钟,放松10分钟,重复3次,每天2次,假手术组只分离血管神经,不作其他任何处理;(2)然后分别于第4周、8周两个时间点进行大鼠神经行为测试,水迷宫实验、高架十字迷宫实验、新旧物体识别实验、神经行为学评分等,来测试大鼠空间学习记忆能力、焦虑情绪、以及神经行为学损伤程度。(3)神经行为学测试结束后,处死大鼠断头取脑,使用Nissl染色来观察大鼠海马组织形态学变化,利用Q-PCR来检测大鼠脑组织中Nrf2及下游因子SOD-2,HO-1等mRNA的表达变化,用Elisa检测Nrf2及下游因子蛋白表达变化,用普通免疫组织化学及免疫荧光实验对阳性细胞进行定位。结果(1)RIPC对于大鼠慢性脑缺血造成的认知能力下降具有改善作用,通过水迷宫实验、高架十字迷宫实验、新旧物体识别实验以及神经行为学评分,结果显示,在水迷宫中,与假手术组比较,BCAO和RIPC组逃避潜伏期和穿越平台次数有显著差异(P0.05)。慢性脑缺血组即BCAO组,与RIPC3d和RIPC4w组比较而言,其逃避潜伏期显著延长(P0.05)穿越平台次数显著减少;在高架十字迷宫和神经行为学评分中,8周时,与假手术组比较,BCAO组的开臂次数明显减少(P0.05),实施RIPC后,其开臂次数明显增多(P0.05)。在新旧物体识别实验中,与BCAO比较,RIPC探索新物体行为和记忆能力明显提高(P0.05),有统计学意义。(2)同时,通过Q-PCR和Elisa的检测可知,RIPC可以上调Nrf2(P0.05)以及其下游因子SOD-2(P0.05),下调炎症因子TNFα(P0.05)以及Tau蛋白(P0.05),同时免疫组织化学实验显示,Nrf2和SOD-2的阳性细胞较BCAO组明显增多,Tau蛋白的阳性细胞明显减少,在尼氏染色中,其结果也显示,与Sham比较,BCAO组海马区神经元损伤较多,尼氏体大量减少,与BCAO组比较,RIPC组尼氏体受损较小。(3)免疫组织化学结果表明,与BCAO组相比,RIPC的Nrf2和SOD-2的阳性细胞数明显增多,且NeuN的免疫荧光结果显示BCAO组大鼠海马区,与Sham组比较,神经元损伤较为严重,,阳性细胞明显减少(P0.05),RIPC组与BCAO组比较,阳性细胞显著增多(P0.05)。结论(1)RIPC可以改善大鼠认知功能以及慢性脑缺血大鼠的学习记忆能力下降、减少其焦虑情绪等。(2)RIPC可能通过参与诱导激活Nrf2-ARE通路,上调其关键因子Nrf2和SOD-2,下调Tau蛋白和TNFα,激活内源性抗氧化应激,减少非正常Tau蛋白的积聚,减少神经元损伤和坏死,保护脑组织。
【关键词】：大鼠 慢性脑缺血 血管性痴呆 Nrf2-ARE信号通路 Tau蛋白 远程缺血后处理
【学位授予单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-15
• 第一部分 远程缺血后处理改善慢性脑缺血大鼠的神经功能15-30
• 1.材料与方法15-16
• 1.1 主要实验仪器15-16
• 2 实验方法16-21
• 2.1 实验动物与分组16
• 2.2 慢性脑缺血动物模型（BCAO）制备16-17
• 2.3 肢体缺血后处理（RIPC）模型制备17
• 2.4 大鼠认知功能的评定17-20
• 2.5 统计方法20-21
• 3 结果21-26
• 3.1 水迷宫实验结果比较21-23
• 3.2 神经行为学结果比较23-24
• 3.3 高架十字迷宫结果比较24-25
• 3.4 新旧物体识别结果比较25-26
• 4 讨论26-29
• 4.1 关于慢性脑缺血26
• 4.2 关于远程缺血后处理-RIPC26-27
• 4.3 关于RIPC的动物模型27
• 4.4 RIPC 改善 BCAO 大鼠的认知功能27-29
• 5 结论29-30
• 第二部分 远程缺血后处理对慢性脑缺血大鼠神经保护作用的机制研究30-55
• 1.材料与方法30-35
• 1.1 主要实验仪器30-31
• 1.2 主要实验试剂31-32
• 1.3 主要试剂配制32-35
• 2 实验方法35-42
• 2.1 Q-PCR35-36
• 2.2 Elisa-蛋白测定36-37
• 2.3 冰冻切片制作37-38
• 2.4 石蜡切片的制作38-39
• 2.5 石蜡切片免疫组织化学染色39
• 2.6 冰冻切片免疫荧光染色39-40
• 2.7 石蜡切片免疫荧光40-41
• 2.8 Nissl染色41-42
• 3 结果42-51
• 3.1 Q-PCR42-43
• 3.2 Elisa43-44
• 3.3 免疫组织化学44-50
• 3.4 Nissal染色50-51
• 4 讨论51-54
• 4.1 RIPC参与调控Nrf2-ARE信号通路51-52
• 4.2 RIPC减少Tau蛋白积聚52-54
• 5 结论54-55
• 参考文献55-59
• 文献综述59-70
• 参考文献66-70
• 附录70-71
• 缩略语全称（英文全称中文全称）71-72
• 攻读学位期间研究成果72-73
• 致谢73-74

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