N-乙酰半胱氨酸可恢复TDP-25所致的运动神经元样细胞持续性钠通道功能异常

发布时间：2017-07-16 04:03

  本文关键词：N-乙酰半胱氨酸可恢复TDP-25所致的运动神经元样细胞持续性钠通道功能异常

  更多相关文章： 肌萎缩侧索硬化 持续性钠通道 TDP-25 氧化应激 N-乙酰半胱氨酸 全细胞膜片钳技术

【摘要】：肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种选择性损害上、下运动神经元的神经变性疾病。本病具有慢性、进行性、致死性的特点。本病的大部分患者是散发型,约10%患者存在家族性常染色体显性遗传史,即为家族型,20%的家族型患者存在铜/锌超氧化物岐化酶(SOD1)基因突变。目前研究发现,约3%的家族型患者以及2.9%散发型患者存在TAR-DNA结合蛋白43(TDP-43)基因突变,表明ALS的发病与TDP-43基因突变有着密切的关系。TDP-43蛋白是一种由定位于chrlp36.2的TARDBP基因编码的核蛋白,具有结合单链DNA、RNA的功能,同时参与m RNA的转录并维持其结构稳定性。许多研究表明,在FTLD-TDP或者ALS患者发现的TDP-43蛋白通常表现为高度磷酸化、泛素化、易裂解、移位到细胞质并聚集。这些特征使TDP-43丧失了正常功能,相反具有毒性作用,诱导细胞凋亡以及运动神经元轴突变短,髓鞘的脱失。目前发现突变的TDP-43会引起线粒体功能障碍、氧化损伤。研究发现TDP-25蛋白的分子量为25k Da,是TDP-43的C末端被酶分解的片段之一。TDP-25可以促进TDP-43包涵体的形成,对运动神经元具有更强的毒性作用。TDP-25引起线粒体功能紊乱以及加速氧化损伤,运动神经元变性,在ALS的发病机制中发挥重要作用。TDP-43可引起细胞的高兴奋性,兴奋性增高的神经元会导致异常动作电位的爆发,引起细胞内钙超载,产生兴奋性毒性。目前研究发现TDP-43的表达会引起细胞线粒体功能障碍,能量不足,加重氧化损伤。主要表现为活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)增多,细胞不能维持正常的清除作用。大量的活性氧聚集使得线粒体膜电位异常以及呼吸链损伤,引起能量依赖性离子通道功能改变,同时使得细胞内高钾和细胞外高钠的离子浓度发生改变。目前研究还发现ALS患者运动神经元钠离子内向电流的增加,其机制主要与持续性钠通道的表达上调和(或)该通道功能异常相关,而内向钠离子电流增大直接导致了运动神经元较易爆发动作电位从而增加了能量的消耗和自由基的产生。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是一种分子量较小的半胱氨酸的衍生物。由于其小的分子量以及分子结构决定了易通过细胞膜,进入细胞后脱乙酰基成为谷胱甘肽的合成的必须氨基酸,又称为还原型谷胱甘肽的前体。NAC的主要功能一方面是维持细胞内氧化还原电势稳定,另一方面还可以透过细胞膜及线粒体膜通过分子内结构清除细胞内的ROS,成为一种有效的抗氧化剂。本实验通过应用不同浓度NAC作用于稳定转染TDP-25运动神经元细胞后记录持续性钠电流,进一步分析NAC对稳定转染TDP-25细胞的作用以及TDP-25在ALS发病机制中的作用。目的:本实验研究目的是分别检测稳定转染TDP-25和空质粒的运动神经元样细胞的持续性钠电流,并比较电流是否存在差别;分析不同浓度N-乙酰半胱氨酸对稳定转染TDP-25运动神经元样细胞的作用。进一步探究稳定转染TDP-25运动神经元样细胞的兴奋性增高与氧化损伤在ALS发病机制中的作用。方法:本实验应用稳定转染TDP-25和Empty(空质粒)两种细胞,该NSC34细胞系由本实验室构建,应用规范的细胞培养方法对其进行培养,首先通过筛选单克隆细胞,然后免疫组化鉴定TDP-25蛋白的表达程度,选择TDP-25蛋白表达95%以上的细胞。将这些筛选后的单克隆细胞系进行培养、传代,获得稳定转染TDP-25细胞以及空质粒细胞。在全细胞膜片钳技术下,记录稳定转染TDP-25细胞、空质粒细胞的持续性钠电流;将终浓度分别为20umol/LNAC、50umol/LNAC、80umol/LNAC作用于TDP-25细胞24小时后,分别记录3组不同浓度下细胞的持续性钠电流的水平。统计持续性钠电流的差异性。结果:TDP-25组与Empty组的持续性钠电流相比,TDP-25组的电流幅度以及电流密度增大(P=0.03,P0.05具有统计学意义)。给予药物浓度分别为20umol/L,50 umol/L,80 umol/L的NAC作用于TDP-25组细胞24小时后的持续性钠电流相比较,50umol/LNAC组的持续性钠电流幅度减少明显(P=0.04,P0.05具有统计学意义);20umol/L组电流幅度减小,与TDP-25组比较变化不明显(P0.05无统计学意义);80 umol/L浓度时发现无明显变化(P0.05无统计学意义)。五组间I-V曲线进行比较分析得出持续性钠电流均存在电压依赖性,曲线呈现一个V字形,Empty组、50μmol/L NAC组I-V曲线较TDP-25组上移。统计结果如下:TDP-25组:n=25电流幅度:-74.69±17.64p A;电流密度:-3.18±1.723 p A/pf Empty组:n=20电流密度:-30.60±6.72p A;电流密度:0.52±0.024p A/pf药物作用TDP-25结果如下:20μmol/L NAC组:n=10电流幅度:-62.62±11.63p A;电流密度:0.52±0.024p A/pf50μmol/L NAC组::n=10电流幅度:-34.56±10.07p A;电流密度:-1.73±0.42 p A/pf80μmol/L NAC组:n=10电流幅度:-66.30±18.23p A;电流密度:-3.06±0.955 p A/pf结论:在本实验中,我们得出稳定表达TDP-25的运动神经元样细胞与对照组比较持续性钠电流明显增大,提示细胞兴奋性水平增高,在ALS的发病机制中起到关键作用。N-乙酰半胱氨酸具有抑制氧化应激减少氧化产物作用,50μmol/L NAC降低持续性钠电流幅度,应用20μmol/L和80μmol/L的NAC不能恢复TDP-25诱导的持续性钠通道功能,提示过少或过多氧自由基的清除,均不能对TDP-25所致的运动神经元变性起到保护作用。
【关键词】：肌萎缩侧索硬化 持续性钠通道 TDP-25 氧化应激 N-乙酰半胱氨酸 全细胞膜片钳技术
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R744.8
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文缩写11-12
• 前言12-14
• 材料与方法14-19
• 结果19-23
• 附图23-29
• 讨论29-31
• 结论31-32
• 参考文献32-37
• 综述 持续性钠电流的相关研究37-50
• 参考文献44-50
• 致谢50-51
• 个人简历51

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本文编号：546953