靶向RWDD3基因shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定

发布时间：2017-07-18 21:14

  本文关键词：靶向RWDD3基因shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定

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【摘要】：目的构建RWD结构小泛素化增强子(RWDD3)shRNA慢病毒表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制人脑胶质瘤细胞RWDD3基因的相关研究奠定基础。方法设计RWDD3的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的载体连接,构建3种重组质粒pGC-LV-shRNA1、pGC-LV-shRNA2和pGC-LV-shRNA3,并转化于DH5α感受态细胞,提取阳性克隆质粒测序,转染293T细胞,生产慢病毒颗粒,并检测病毒滴度。将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别感染人脑胶质瘤细胞U251,实时定量PCR和Western blot分别检测RWDD3mRNA和蛋白的沉默效果。结果测序结果证实3种慢病毒载体均包装成功,滴度分别为5×10~(11) TU/L、4×10~(11) TU/L、5×10~(11) TU/L。感染U251后,RWDD3mRNA及蛋白的表达量均较阴性对照组和未感染组明显降低(P0.05);其中以LV-RWDD3-shRNA-1作用显著,mRNA表达下调79.2%,蛋白表达下调68.2%(P0.05);而阴性感染对照组和未感染组相比差异无统计学意义(P0.05)。结论成功构建3种RWDD3shRNA慢病毒表达,可有效下调U251细胞RWDD3mRNA和蛋白的表达,其为进一步研究以RWDD3为靶点的脑胶质瘤基因治疗提供稳定转染细胞的载体奠定基础。
【作者单位】： 南昌大学第二附属医院神经外科;
【关键词】： 脑胶质瘤 RWDD 慢病毒 shRNA
【基金】：江西省自然科学基金计划项目(No.20132BAB205043) 江西省教育厅科学技术研究项目(No.GJJ14066)~~
【分类号】：R739.41;R3416
【正文快照】： 脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,系统Lentivector　Packaging　Kit购自上海吉凯基因具有无控性增殖、侵袭性生长、易复发、预后极差的特化学公司;限制性内切酶AgeⅠ、EcoRⅠ和连接试剂点[1-2]。其本质上是一种多基因异常疾病,由于原癌盒购自NEB公司;质粒提取试剂盒

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本文编号：559792