新生期反复惊厥性脑损伤中生酮饮食的调节作用及信号通路研究

发布时间：2017-07-21 01:00

  本文关键词：新生期反复惊厥性脑损伤中生酮饮食的调节作用及信号通路研究

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【摘要】：目的:探讨生酮饮食长期应用对三氟乙醚诱导的大鼠新生期反复惊厥性脑损伤的调节作用及对脑内信号通路的影响。方法:采用随机数表法将48只8日龄(P8表示,下同)的Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分成两组:对照组(NS组)和惊厥组(RS组)。适应性喂养一天后,惊厥组大鼠通过三氟乙醚反复吸入诱导新生期反复惊厥发作,每次惊厥持续30min,每日一次,连续惊厥8天,对照组中除不吸入三氟乙醚外其他处理相同。P20天依据是否需要生酮饮食干预,将每组大鼠再随机分成两组,即:单纯对照组(NS+ND组)、生酮饮食组(NS+KD组)、单纯惊厥组(RS+ND组)、惊厥+生酮饮食组(RS+KD组),每组12只。各组大鼠断奶并禁饮食一天后,于P21天开始饮食干预,NS+ND组及RS+ND组给予正常饮食,NS+KD组及RS+KD组给予生酮饮食,饮食干预三周。于P21、P28、P35、P42天监测血酮及血糖的变化,实验期间定期监测大鼠体重变化。于P28、P35天进行神经反射评测(平面翻正试验、悬崖回避试验、前肢悬吊试验、负向趋地试验),P35天进行旷场试验,于P37-43天期间行Morris水迷宫测试。P43天水迷宫结束后分离大脑皮质和海马组织,免疫印迹技术(Western blot)检测Cathepsin E、CLU、Beclin-1、Bcl-2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、c PLA2的表达。Neo-Timm’s染色检测海马苔藓纤维发芽。结果:1.体重变化:四组大鼠体重存在显著的组间差异[F(3,33)=383.9,P0.0001],进一步比较发现,P21-P43期间各监测时间点RS+ND组大鼠体重较NS+ND组明显降低(P0.05);P25-P43各个监测时间点NS+KD组大鼠体重较NS+ND组明显降低(P0.05);P25-P43各个监测时间点,RS+KD组较RS+ND组大鼠体重明显降低(P0.05)。2.神经行为:(1)平面翻正试验:P28天四组大鼠平面翻正时间无显著性差异(F=1.590,P=0.2050.05);P35天四组间无显著性差异(F=1.200,P=0.3210.05)。(2)悬崖回避试验:P28天四组大鼠悬崖回避时间无显著性差异(F=2.245,P=0.0960.05);P35天四组间有显著性差异(F=11.740,P=0.0000.05),两两比较,RS+ND组较NS+ND组明显延长(P0.05),RS+KD组较RS+ND组明显缩短(P0.05)。(3)前肢悬吊试验:P28天四组大鼠前肢悬吊时间无显著性差异(F=2.017,P=0.1250.05);P35天四组间有显著性差异(F=7.355,P=0.0000.05),两两比较,RS+ND组较NS+ND明显缩短(P0.05),RS+KD组较RS+ND组明显延长(P0.05)。(4)负向趋地试验:P28天四组大鼠负向趋地时间有显著性差异(F=7.362,P=0.0000.05),两两比较,RS+ND组较NS+ND组明显延长(P0.05),RS+KD组时间较RS+ND组明显缩短(P0.05);P35天四组间有显著性差异(F=10.961,P=0.0000.05),两两比较,RS+ND组较NS+ND组明显延长(P0.05),RS+KD组较RS+ND组明显缩短(P0.05)。(5)旷场试验:四组大鼠延迟时间有显著性差异(F=23.961,P=0.0000.05),两两比较,RS+ND组较NS+ND组明显延长(P0.05),RS+KD组较RS+ND组明显缩短(P0.05);四组大鼠水平得分有显著性差异(F=7.290,P=0.0000.05),两两比较,RS+ND组较NS+ND组明显减少(P0.05),RS+KD组与RS+ND组差异无统计学意义(P0.05);四组大鼠垂直得分有显著性差异(F=4.858,P=0.0050.05),两两比较,RS+ND组较NS+ND组明显减少(P0.05),RS+KD组较RS+ND组明显增加(P0.05);四组大鼠开场得分有显著性差异(F=7.785,P=0.0000.05),两两比较,RS+ND组较NS+ND组明显减少(P0.05),RS+KD组较RS+ND组明显增加(P0.05);四组大鼠修饰次数无显著性差异(F=0.391,P=0.7600.05);四组大鼠大便粒数有显著性差异(F=14.625,P=0.0000.05),两两比较,RS+ND组大便颗粒数较NS+ND组增多(P0.05),RS+KD组较RS+ND组减少(P0.05)。3.Morris水迷宫:(1)定位航行试验:重复测量双因素方差分析(repeated two way ANOVA)结果显示:四组大鼠逃避潜伏期存在组间显著性差异[F(3,33)=11.79,P0.0001]、训练天数间显著性差异[F(4,44)=13.34,P0.0001]以及组间因素与训练天数因素之间显著的交互作用[F(12,132)=2.661,P=0.0031],进一步的比较发现,第2天开始RS+ND组及RS+KD组时间均较NS+ND组延长,RS+ND组与NS+ND组在第3、4、5天均存在显著性差异(P0.05),而RS+KD组与NS+ND组仅在第4天存在显著性差异(P0.05)。(2)空间探索实验:四组大鼠穿越平台次数有显著性差异(F=6.478,P=0.0010.05),两两比较,穿越平台次数RS+ND组较NS+ND组明显减少(P0.05),RS+KD组较RS+ND组明显增加(P0.05)。4.Neo-Timm’s染色结果:四组大鼠海马CA3区苔藓纤维异常发芽半定量评分有显著性差异(F=27.652,P=0.0000.05),两两比较,苔藓纤维异常发芽程度RS+ND组较NS+ND组明显增高(P0.05),RS+KD组较RS+ND组明显降低(P0.05);四组大鼠海马齿状回苔藓纤维异常发芽半定量评分有显著性差异(F=9.809,P=0.0000.05),两两比较,苔藓纤维异常发芽程度RS+ND组较NS+ND组明显增高(P0.05),RS+KD组较RS+ND组明显降低(P0.05)。5.Western blot结果:(1)四组大鼠大脑皮层组织Cathepsin E表达有显著性差异(F=5.377,P=0.0070.05),两两比较,RS+ND组Cathepsin E表达较NS+ND组明显增高(P0.05),RS+KD组Cathepsin E表达较RS+ND组明显降低(P0.05);四组大鼠海马组织中Cathepsin E表达有显著性差异(F=9.167,P=0.0010.05),两两比较,RS+ND组Cathepsin E表达较NS+ND组明显增高(P0.05),RS+KD组Cathepsin E表达较RS+ND组明显降低(P0.05)。(2)四组大鼠大脑皮层CLU表达有显著性差异(F=3.340,P=0.0400.05),两两比较,RS+ND组CLU表达较NS+ND组明显升高(P0.05),RS+KD组CLU表达较RS+ND组明显降低(P0.05);四组大鼠海马组织中CLU表达有显著性差异(F=6.139,P=0.0040.05),两两比较,RS+ND组CLU表达较NS+ND组明显升高(P0.05),RS+KD组CLU表达较RS+ND组明显降低(P0.05)。(3)四组大鼠大脑皮层Beclin-1表达无显著性差异(F=0.697,P=0.5650.05);四组大鼠海马组织中Beclin-1表达有显著性差异(F=3.186,P=0.0460.05),两两比较,RS+ND组Beclin-1表达较NS+ND组明显升高(P0.05),其余各组差异无统计学意义(P0.05)。(4)四组大鼠大脑皮层Bcl-2表达无显著性差异(F=1.695,P=0.2000.05);四组大鼠海马Bcl-2表达无显著性差异(F=0.929,P=0.4450.05)。(5)四组大鼠大脑皮层Beclin-1/Bcl-2表达无显著性差异(F=2.018,P=0.1440.05);四组大鼠海马Beclin-1/Bcl-2表达无显著性差异(F=0.249,P=0.8610.05)。(6)四组大鼠大脑皮层组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ有显著性差异(F=3.704,P=0.0290.05),两两比较,RS+ND组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达较NS+ND组明显降低(P0.05),RS+KD组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达较RS+ND组明显升高(P0.05);四组大鼠海马组织中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达有显著性差异(F=3.692,P=0.0290.05),两两比较,RS+ND组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达较NS+ND组明显降低(P0.05),RS+KD组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达较RS+ND组明显升高(P0.05)。(7)四组大鼠大脑皮层p62表达有显著性差异(F=5.498,P=0.0060.05),两两比较,RS+ND组p62表达较NS+ND组明显升高(P0.05),RS+KD组p62表达较RS+ND组明显降低(P0.05);四组大鼠海马中p62表达有显著性差异(F=5.095,P=0.0090.05),两两比较,RS+ND组p62表达较NS+ND组明显升高(P0.05),RS+KD组p62表达较RS+ND组明显降低(P0.05)。(8)四组大鼠大脑皮层c PLA2表达无显著性差异(F=0.875,P=0.4710.05);四组大鼠海马c PLA2表达有显著性差异(F=4.365,P=0.0160.05),两两比较,RS+ND组c PLA2表达较NS+ND组明显降低(P0.05),RS+KD组c PLA2表达较RS+ND组明显升高(P0.05)。结论:1.三氟乙醚诱导的新生期大鼠反复惊厥发作可对大鼠生长发育、神经行为及认知功能造成损害,生酮饮食长期干预能够显著改善神经行为及认知功能损伤。2.惊厥后采用生酮饮食干预能够抑制新生期大鼠反复惊厥发作所致海马CA3区及齿状回苔藓纤维异常发芽。3.三氟乙醚诱导的新生期反复惊厥后远期海马及皮层组织中存在自噬相关分子Cathepsin E、Beclin-1(海马)和p62上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ下调,以及抗凋亡分子CLU上调和细胞内磷脂酶A2(c PLA2)表达下调(海马)。生酮饮食对上述异常表达分子具有显著调节作用。4.研究提示,新生期惊厥性脑损伤远期海马及皮层中存在自噬及脂代谢相关分子表达的变化。生酮饮食的神经保护作用可能与调节上述两种信号通路有关。
【关键词】：生酮饮食 新生期惊厥 自噬 Beclin-1 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ p62 cPLA2
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.1
【目录】：

• 摘要4-8
• Abstract8-12
• 引言12-15
• 第一部分 新生期反复惊厥对大鼠远期神经行为及认知能力的影响以及生酮饮食的干预作用15-31
• 材料与方法15-19
• 结果19-30
• 小结30-31
• 第二部分Neo-Timm’s染色法观察海马苔藓纤维发芽31-34
• 材料与方法31-33
• 结果33-34
• 第三部分CathepsinE、CLU、Beclin-1、Bcl-2、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62 及cPLA2在四组大鼠海马和皮层的表达情况34-49
• 材料与方法34-39
• 结果39-48
• 小结48-49
• 讨论49-56
• 结论56-57
• 参考文献57-63
• 附图63-65
• 综述65-76
• 参考文献72-76
• 中英文对照缩略词表76-77
• 攻读学位期间公开发表的论文77-78
• 本课题资助项目78-79
• 致谢79-80

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本文编号：570710