硫化氢对PC12细胞自噬和α-synuclein降解的调控作用及分子机制

发布时间：2017-07-31 05:25

  本文关键词：硫化氢对PC12细胞自噬和α-synuclein降解的调控作用及分子机制

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【摘要】：目的:研究气体信号分子硫化氢对PC12细胞自噬和α-synuclein的降解调控作用,并探讨相关分子机制。方法:以高分化PC12细胞为工具细胞;用环境毒素鱼藤酮建立帕金森病细胞模型;分别以硫氢化钠(Sodium hydrosulfide,Na HS)和GYY4137为硫化氢的速释和缓释供体。用MTT法检测细胞活力;Western blot方法检测自噬底物蛋白SQSTM1/p62(sequestosome-1)、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain3,LC3)、非m TOR依赖通路蛋白Beclin1、m TOR依赖通路及上游激酶AMPK、m TOR和p70S6K及其磷酸化水平、以及α-synuclein的蛋白表达变化;使用NP40法进一步分离可溶和不可溶性α-synuclein;运用反转录PCR(reverse-transcription PCR,rt-PCR)方法检测α-synuclein的转录水平;瞬时转染GFP-LC3质粒,荧光显微镜观察硫化氢处理后LC3点状荧光表达分布的变化;Biotin Switch Technique(BST)检测AMPK的硫巯基化(S-sulfhydration)变化。结果:(1)以50、100和200μM Na HS作用于PC12细胞24h,LC3II蛋白水平升高,而p62蛋白表达下降,其中100μM Na HS作用最为显著,与空白对照组相比具有统计学差异;以25、50和100μM GYY4137作用后,LC3II和p62蛋白表达出现类似变化,GYY4137在50μM时作用最为显著,与对照组相比具有统计学差异。而且,100μM Na HS和50μM GYY4137作用24h,均使得转染了GFP-LC3的PC12细胞LC3II点状聚集数目增加。上述剂量范围的Na HS和GYY4137作用24h,对细胞活力无明显影响。(2)Na HS和GYY4137作用后,Beclin 1蛋白水平并无明显改变;然而,100μM Na HS能够抑制m TOR及其下游底物p70S6K的磷酸化,而升高其上游激酶AMPK的磷酸化水平,50μM GYY4137亦有此作用;此外,Na HS能够显著升高AMPK的S-sulfhydration修饰水平。(3)100 n M鱼藤酮单独作用PC12细胞24h后,α-synuclein蛋白水平明显升高,其中NP40不可溶部分α-synuclein约增加3倍,Na HS预处理能显著减少鱼藤酮诱导的α-synuclein的蓄积,而RT-PCR结果显示鱼藤酮和Na HS单独作用对α-synuclein的m RNA水平均无显著影响。(4)Na HS预处理能显著减少鱼藤酮所引起的p62升高和LC3下降,提示硫化氢可能通过上调自噬水平、促进α-synuclein的自噬性降解而减少其在细胞内的蓄积。结论:在一定的剂量范围内,硫化氢通过S-sulfhydration修饰促进AMPK磷酸化增加、抑制m TOR/p70S6K活性而上调PC12细胞内的自噬活性,减少α-synuclein在胞内的蓄积。
【关键词】：硫化氢 自噬 α-synuclein 帕金森病 硫巯基化修饰
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.5
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-15
• 参考文献12-15
• 材料和方法15-28
• 1 实验材料15-18
• 1.1 主要试剂15-16
• 1.2 主要仪器16
• 1.3 溶液配制16-18
• 2 实验方法18-28
• 2.1 细胞株18
• 2.2 细胞复苏18-19
• 2.3 细胞的传代19
• 2.4 MTT检测细胞活力19
• 2.5 Western blot检测蛋白表达19-21
• 2.6 RT-PCR技术检测mRNA的表达21-23
• 2.7 质粒的扩增23
• 2.8 质粒DNA小量提取23-24
• 2.9 转染GFP-LC324-25
• 2.10 NP-40 法分离可溶和不可溶 α-synuclein25-26
• 2.11 Biotin Switch Technique(BST)检测S-巯基化水平26-27
• 2.12 统计方法27-28
• 结果28-37
• 1 NaHS和GYY4137 对PC12 细胞活力的影响28
• 2 H_2S诱导PC12 细胞自噬活性上调28-30
• 3 H_2S抑制MTOR/P70S6K信号通路活性30-32
• 4 H_2S促使AMPK磷酸化升高32-33
• 5 H_2S促使AMPK硫巯基化修饰增加33-34
• 6 H_2S能逆转鱼藤酮诱导的自噬障碍及 α-synuclein的聚集34-37
• 讨论37-41
• 参考文献41-44
• 结论44-45
• 综述 气体信号分子NO、CO和H_2S的生物学研究进展45-55
• 摘要45-46
• 1 NO46-48
• 1.1 NO的合成代谢46
• 1.2 NO的生物学功能46-47
• 1.3 NO的分子转导机制47-48
• 2 CO48-49
• 2.1 CO合成代谢48
• 2.2 CO的生物学功能48-49
• 2.3 CO信号转导机制49
• 3 H_2S49-52
• 3.1 H_2S的合成代谢49-50
• 3.2 H_2S的生物学功能50-51
• 3.3 H_2S的信号转导机制51-52
• 4 结语与展望52
• 参考文献52-55
• 攻读学位期间公开发表的论文及科研成果55-56
• 中英文对照缩略词表56-57
• 致谢57-58

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本文编号：597685