表达NR1的293T细胞构建及其在抗NMDA受体自身抗体检测中的应用

发布时间：2017-08-02 11:40

  本文关键词：表达NR1的293T细胞构建及其在抗NMDA受体自身抗体检测中的应用

  更多相关文章： 抗NMDA受体脑炎 NMDA受体 慢病毒载体 293T细胞 自身抗体检测

【摘要】：抗NMDA受体脑炎(anti-NMDA receptor encephalitis)具有类似于边缘叶脑炎症状特点,如认知障碍、精神行为异常、癫痫发作、意识障碍等,其中精神行为异常较边缘叶脑炎更重,同时认知障碍更加典型和突出,并可有累及脑干产生的中枢性通气不足、意识不清等症状。NMDA受体广泛分布于神经系统,在端脑、胼胝体回、海马、丘脑、纹状体、小脑、脑干、脊髓、肠道神经等均有大量分布,其他部位也有存在。目前抗NMDA受体脑炎诊断主要依据是抗NMDA受体NR1亚基IgG抗体(+)。NR1亚基IgG抗体在抗NMDA受体脑炎患者脑脊液中阳性率为100%。抗NMDA受体抗体检测对抗NMDA脑炎的诊断具有非常高的敏感性和特异性。目前实验室检查金标准为间接免疫荧光法,目前生产该检测试剂盒的均是欧洲和美国厂家,其中在国内被大量使用并被临床验证过的检测试剂盒是欧蒙公司生产的抗体检测试剂盒。价格昂贵。如果检测患者抗体滴度,以及同时检测血清、脑脊液标本,则单次检查费用要提高数倍。研究目的:通过构建过表达NMDA受体NR1亚基的293T细胞,实现一种成本较低的检测抗NMDA受体自身抗体的检测方法,并在实验室内初步进行抗NMDA受体脑炎患者抗体检测并与商品化试剂盒进行比较验证检测效率。研究方法:1、对携带GRIN1基因的载体质粒进行PCR扩增,获得GRIN1全长编码序列,然后通过酶切、连接将该序列接入FUGW质粒载体,获得FUGW-GRIN1-IRES-EGFP质粒。2、将连接后载体转化感受态大肠杆菌,进行质粒扩增,收集并鉴定质粒。3、通过四质粒系统将FUGW-GRIN1-IRES-EGFP转染293T细胞,进行慢病毒包装。4、待293T细胞内病毒包装、释放完毕,收集含病毒载体的细胞培养液,通过离心收集病毒。5、用携带GRIN1基因的慢病毒载体感染目标细胞293T细胞并验证GRIN1基因表达。6、以实验室保存的经检测抗NMDA受体抗体阳性以及阴性的病人脑脊液样本孵育表达GRIN1的293T细胞,并进行免疫荧光检测,分析样本中的抗体情况并与商品化试剂盒进行比对。研究结果:1、成功构建慢病毒载体FUGW-GRIN1-IRES-EGFP。2、成功包装携带GRIN1基因的慢病毒颗粒。3、成功构建过表达GRIN1基因的293T细胞。4、过表达293T细胞对抗NMDA受体抗体的检测阳性率,与商品化试剂盒的一致率为95%。结论:1.选择与国外产品不同的构建方法,优选慢病毒载体系统构建过表达GRIN1基因的细胞株,我们成功的将慢病毒颗粒感染293T细胞并高效表达NMDA受体NR1亚基蛋白。2.对于脑脊液内抗体滴度的估测,我们与国外检测试剂盒的估测结果相符。与国外试剂盒相比,我们采用双荧光标记,检测前观察绿色荧光表达情况即可判断目的基因的表达情况,过程简单,并且能够减少因构建细胞不表达或少量表达GRIN1基因而产生的假阴性结果,同时在抗体滴度的计算上更具有优势。4.根据目前实验结果,该项技术具有应用于实验室检测的应用前景。
【关键词】：抗NMDA受体脑炎 NMDA受体 慢病毒载体 293T细胞 自身抗体检测
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.9
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 主要英文缩略语词表9-10
• 前言10-12
• 第一部分 表达GRIN1基因慢病毒载体的构建及鉴定12-37
• 一、实验材料12-17
• 二、主要实验步骤17-29
• 三、实验结果29-35
• 四、讨论35-37
• 第二部分 应用表达NR1的 293T细胞爬片检测抗NMDA受体抗体脑炎患者脑脊液37-43
• 一、试验材料37-38
• 二、主要实验方法38-40
• 三、结果40-41
• 四、讨论41-43
• 存在问题与展望43
• 参考文献43-46
• 综述46-59
• 参考文献53-59
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明59-60
• 致谢60

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 ;ONO-1078 reduces NMDA-induced brain injury and vascular cell adhesion molecule-1 expression in rats[J];Acta Pharmacologica Sinica;2005年04期

2 魏郢;张晓琴;;癫痫与NMDA受体的研究进展[J];脑与神经疾病杂志;2009年03期

3 罗蔚锋,邵国富;NMDA受体与癫痫发作[J];中国临床神经科学;1998年01期

4 庞志平,王殿仕,郝建东,朱长庚,王阿敬,李继硕;The Effect of Coriaria Lactone on NMDA Receptor Mediated Currents in Rat Hippocampal CA1 Neurons[J];Journal of Tongji Medical University;2000年01期

5 姚凤莉,罗分平,李海南;NMDA受体与癫痫及学习、记忆的关系[J];中国优生与遗传杂志;2004年04期

6 梁英武,单巍松,张国荣,王朝晖,吴希如;小剂量NMDA对谷氨酸兴奋性神经毒性作用的拮抗及机制研究[J];济宁医学院学报;1998年02期

7 陈鹏慧,阮怀珍,吴喜贵;缺氧及谷氨酸对大鼠下丘脑神经元NMDA通道的影响[J];第三军医大学学报;2001年04期

8 ;Lead Can Inhibit NMDA-,K~+-,QA/KA-Induced Increases in Intracellular Free Ca~(2+) in Cultured Rat Hippocampal Neurons[J];Biomedical and Environmental Sciences;2002年04期

9 陈文玲,杨s，

本文编号：609124