β-arrestin1与STAT3的相互作用及对神经胶质瘤细胞增殖影响的研究

发布时间：2017-08-03 09:21

  本文关键词：β-arrestin1与STAT3的相互作用及对神经胶质瘤细胞增殖影响的研究

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【摘要】：目的：根据前期试验结果及以往研究,我们假设：β-arrestinl可促进STAT3的修饰,这种修饰的增强对神经胶质瘤的增殖起到重要影响。本研究确认了β-arrestinl对STAT3修饰的影响,探讨了β-arrestinl与STAT3的相互作用及其对神经胶质瘤增殖的影响。方法：1.验证β-arrestinl与STAT3之间的相互结合：①将6myc-βarrestinl与flag-STAT3质粒共同转染入293T细胞中,用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,COIP)法检测6myc-βarrestin1与flag-STAT3之见的相互作用②转染pds-red-STAT3质粒与YFP-N1-parrestinl质粒：将pds-red-STAT3与β-arrestinl-GFP质粒共同转染入293T细胞中,荧光显微镜下观察二者的结合2.过表达β-arrestin1,观察C6细胞内STAT3蛋白修饰及表达的影响：按梯度(0.5,1,2μg)将β-arrestinl质粒转染入C6细胞,免疫沉淀法(Immunoprecipitation, IP)纯化内源性STAT3蛋白,免疫印迹技术检测STAT3磷酸化修饰及STAT3表达量的变化3.过表达β-arrestin1,观察C6细胞生长状况：①C6细胞转染：实验组转染β-arrestin1质粒,对照组转染PCDNA3.0质粒②MTT法检测细胞增殖：96孔板每孔中加入20ulMTT溶液,培养4h后,终止反应。随后每孔加入150ul二甲基亚砜,在摇床上低速振荡10min,使用酶联免疫检测仪,在吸光度(OD490nm)处测量各孔的吸光值。4.谷氨酰胺对神经胶质瘤细胞生长的影响：分别用不含谷氨酰胺的DMEM培养基,正常DMEM培养基培养大鼠神经胶质瘤细胞(C6细胞)24小时,倒置显微镜下观察细胞生长状态。5.谷氨酰胺对神经胶质瘤细胞内源性STAT3表达及修饰的影响：谷氨酰胺按时间梯度(0,1,5,10,15,30,60,90分钟)刺激大鼠神经胶质瘤细胞(C6细胞),用免疫沉淀法(Immunoprecipitation, IP)纯化内源性STAT3蛋白。免疫印迹技术检测STAT3磷酸化修饰及STAT3表达量的变化6.谷氨酰胺对STAT3和(3-arrestin1结合的影响：将6myc-β-arrestin1质粒转入C6细胞中,实验组用1mM谷氨酰胺刺激,通过CO-IP法观察内源性STAT3与6myc-(3-arrestin1的结合结果：1. Western blotting结果表明6myc-βarrestin1与flag-STAT3之间可以相互结合,荧光显微镜显示pds-red-STAT3与β-arrestin1-GFP质粒可相互结合2. Western blotting结果表明,过表达β-arrestin1增强了C6细胞内STAT3的磷酸化修饰,但对STAT3蛋白的表达量无显著影响3.酶联免疫检测仪的吸光值表示,过表达β-arrestin1的C6细胞比正常状态下增殖比例升高4.倒置显微镜下显示,使用不含谷氨酰胺DMEM培养基培养后的C6细胞与使用含有谷氨酰胺的DMEM培养基相比,细胞数目明显减少,并且细胞形态有所改变5. Western blotting结果表明,在谷氨酰胺刺激下,C6细胞内STAT3的磷酸化修饰在60分钟左右有显著变化,而STAT3蛋白的表达量无明显改变6. Western blotting结果表明,谷氨酰胺刺激下STAT3和(3-arrestin1结合增强结论：1. p-arrestin1与STAT3之间可以相互结合2.过表达P-arrestin1可促进C6细胞内STAT3磷酸化修饰,但对STAT3蛋白的表达量无影响。3.过表达β-arrestinl可促进神经胶质瘤细胞的生长。4.谷氨酰胺可促进神经胶质瘤细胞的增殖5.谷氨酰胺可增强神经胶质瘤细胞内源性STAT3磷酸化修饰,但对STAT3蛋白的表达量无影响。6.在谷氨酰胺刺激下,STAT3和β-arrestinl结合增强创新及意义：神经胶质瘤简称胶质瘤,是目前最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,约占所有颅内原发肿瘤的一半,具有极大的危害性。在肿瘤的发生发展过程中,信号转导子和转录激活子3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3, STAT3)作为因子和生长因子受体的细胞质转录因子,发挥着重要作用。其激活过程目前已被证明为以下过程：(1)首先,细胞外因子与细胞膜受体结合(2)JAK信号通路活化,并发生自身磷酸化(3)激活后,JAK可以磷酸化一个或多个位点,继而激活下游STAT3 (4) STAT3发生Tyr705和Ser727位点的磷酸化(5)STAT3从受体上解离,转移至细胞核中,从而发挥调控相关基因表达等生理学作用。研究表明,在多种肿瘤细胞及组织中,STAT3的表达常发生异常升高。STAT3的过度激活,会导致正常细胞发生增殖异常,且细胞的自身凋亡受阻,从而诱导肿瘤的发生。因此,STAT3信号通道被认为可能成为肿瘤基因治疗的全新靶点,目前针对STAT3的阻断治疗研究也已成为近年研究的热点。而我们的结果表明,β-arrestinl可以增强STAT3的修饰,并对神经胶质瘤的增殖起到一定影响。而谷氨酰胺(Gln)对细胞增殖的影响可能与其增强了P-arrestinl与STAT3的结合有关。这可能为神经胶质瘤的治疗提供一种潜在的治疗方式。
【关键词】：神经胶质瘤 谷氨酰胺 β-arrestin1 STAT3
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.4
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符号说明13-15
• 前言15-19
• 材料与方法19-31
• 实验结果31-37
• 讨论37-40
• 参考文献40-47
• 致谢47-48
• 学位论文评阅及答辩情况表48

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本文编号：613614