HDAC6在异常聚集tau蛋白的降解过程中的作用及机制研究

发布时间：2017-08-04 18:30

  本文关键词：HDAC6在异常聚集tau蛋白的降解过程中的作用及机制研究

  更多相关文章： 组蛋白去乙酰化酶6 tau蛋白 泛素锌指结合域 自噬-溶酶体系统

【摘要】：Tau蛋白的异常病理性聚集是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)等神经退行性疾病的重要病理学标志之一。研究异常tau蛋白的降解机制对于AD等tau蛋白相关疾病的治疗具有重要临床指导意义。细胞内短期和可溶性低分子量蛋白质主要经泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)进行降解。然而,在tau相关疾病中,蛋白酶体普遍存在功能障碍,进而导致错误折叠的tau蛋白不能经UPS进行有效清除。组蛋白去乙酰化酶6 (Histone deacetylase 6, HDAC6)可与泛素化底物蛋白结合,在动力蛋白的参与下将底物蛋白沿着微管运输到微管组织中心(microtubule organizing center, MTOC)形成功能性蛋白质聚集体(aggresome),并激活自噬-溶酶体途径,最终使得含有底物蛋白的聚集体结构经自噬-溶酶体途径降解。因此,自噬途径在蛋白酶体活性抑制时对于维持胞内的蛋白质含量恒定具有重要的代偿意义。HDAC6的泛素锌指结合域(binder of ubiquitin zinc finger domain, BUZ)可与单体泛素以及多聚泛素链结合,且已有的研究表明,HDAC6可介导tau蛋白聚集体的形成,但具体机制尚不明确。因此,我们推测蛋白酶体活性抑制时,可介导泛素化tau蛋白含量的增加,而HDAC6通过其BUZ结构域与泛素化tau蛋白结合,介导tau蛋白聚集体的形成,并通过激活自噬-溶酶体途径促进tau蛋白的降解。目的：利用蛋白酶体抑制剂MG132处理小鼠神经瘤母细胞(mouse neuroblastoma N2a cells, Neuro-2a),诱导泛素化tau蛋白质的聚集,探讨HDAC6对异常聚集tau蛋白降解的作用及机制。方法：(1)用siRNA方法抑制N2a细胞中HDAC6的表达,通过免疫印迹法检测HDAC6 siRNA处理对HDAC6含量的影响；(2)用siRNA方法抑制N2a细胞中HDAC6的表达,6hr后分别转染FLAG-HDAC6和FLAG-HDAC6 ΔBUZ质粒36 hr,免疫印迹技术检测质粒是否转染成功；(3)用siRNA方法抑制N2a细胞中HDAC6的表达,6hr后分别转染FLAG-HDAC6和FLAG-HDAC6 ABUZ质粒,36hr后利用MG132 (5μM)处理N2a细胞24 hr,抑制蛋白酶体功能,免疫印迹技术检测tau蛋白含量变化；(4)在(3)的条件下用免疫印迹技术检测自噬活性标志物LC3的表达；(5)向N2a细胞内分别共转染FLAG-HDAC6和EGFP-tau、FLAG-HDAC6 ABUZ和EGFP-tau质粒,36 hr后用MG132 (5μM)分别处理细胞12 hr和24 hr,免疫荧光技术观察HDAC6和tau在细胞中的定位关系和tau蛋白功能性聚集体的形成情况；(6)在(5)的条件下,利用免疫沉淀技术检测HDAC6和tau蛋白的相互作用。结果：(1)用20 nM的HDAC6 siRNA处理N2a细胞6hr, N2a细胞中HDAC6表达下降最明显,达80%(P0.001)。(2) FLAG抗体检测FLAG-HDAC6 和 FLAG-HDAC6 ΔBUZ质粒的转染效率,结果发现FLAG-HDAC6与FLAG-HDAC6ΔBUZ转染组细胞中,FLAG表达水平明显增加。(3)与对照组相比,MG132处理组细胞中tau蛋白含量上升(P0.05)；与MG132处理组相比,FLAG-HDAC6质粒转染组细胞中tau蛋白含量显著性降低(P0.05)；与FLAG-HDAC6质粒转染组相比,FLAG-HDAC6 ABUZ质粒转染组细胞中tau蛋白含量则显著增加(P0.05)。(4)与对照组相比,MG132处理组细胞中自噬活性标志物LC3表达上调(P0.05)；与MG132处理组相比,FLAG-HDAC6质粒转染组细胞中LC3表达显著增加(P0.05)；与FLAG-HDAC6质粒转染组相比,FLAG-HDAC6 ΔBUZ质粒转染组细胞中LC3表达则明显降低(P0.05)。(5)与对照组相比,MG132处理组HDAC6与tau蛋白向核周聚集,并出现tau蛋白聚集体,HDAC6和tau具有较好的共定位关系；与共转染FLAG-HDAC6和EGFP-tau质粒组相比,共转染FLAG-HDAC6 ΔBUZ和EGFP-tau组细胞中,tau蛋白散在分布于胞浆中,无tau蛋白聚集体形成,HDAC6与tau蛋白的共定位消失。(6)与对照组相比,MG132处理组HDAC6与tau蛋白之间结合增强(P0.05)；与共转染FLAG-HDAC6和EGFP-tau组细胞相比,共转染FLAG-HDAC6和EGFP-tau ΔBUZ组细胞中,HDAC6与tau蛋白之间结合减弱(P0.05)。结论：以上结果表明,蛋白酶体活性抑制时,HDAC6通过增强与tau蛋白的结合,参与tau蛋白聚集体的形成,并通过激活自噬-溶酶体途径使tau蛋白得到有效降解。本研究以N2a细胞为模型,初步探讨了HDAC6在蛋白酶体活性抑制时参与tau蛋白降解的途径及机制,为进一步明确HDAC6在tau蛋白经自噬-溶酶体途径降解中发生的作用及机制提供了较好的实验依据。
【关键词】：组蛋白去乙酰化酶6 tau蛋白 泛素锌指结合域 自噬-溶酶体系统
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 1. 前言12-22
• 1.1 微管相关蛋白tau及相关疾病12-14
• 1.1.1 Tau蛋白的结构与功能12-14
• 1.1.2 Tau蛋白相关疾病14
• 1.2 泛素-蛋白酶体系统14-15
• 1.2.1 组成成分及功能14-15
• 1.2.2 泛素-蛋白酶体系统对tau蛋白的降解15
• 1.3 自噬-溶酶体系统15-16
• 1.3.1 自噬-溶酶体系统15-16
• 1.3.2 自噬-溶酶体系统对tau蛋白的降解16
• 1.4 组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)16-21
• 1.4.1 HDACs家族16-17
• 1.4.2 HDAC6的结构与功能17-18
• 1.4.3 HDAC6与tau蛋白的相互作用关系18
• 1.4.4 HDAC6对蛋白质降解过程的调控18-20
• 1.4.5 泛素锌指结合域(binder of ubiquitin zinc finger domain,BUZ)20-21
• 1.5 本研究的目的及意义21-22
• 2. 材料与方法22-29
• 2.1 实验仪器22
• 2.2 化学试剂及抗体22-23
• 2.2.1 主要化学试剂22-23
• 2.2.2 抗体23
• 2.3 细胞传代培养23
• 2.4 HDAC6 siRNA23-24
• 2.5 质粒转染24
• 2.6 细胞加药处理24-25
• 2.7 免疫印迹25-26
• 2.7.1 蛋白质样品制备25
• 2.7.2 SDS-PAGE凝胶电泳25-26
• 2.7.3 转膜26
• 2.7.4 显色26
• 2.8 免疫沉淀26-27
• 2.9 免疫荧光27-28
• 2.10 数据分析28-29
• 3. 实验结果29-35
• 3.1 HDAC6 siRNA处理对内源性HDAC6表达的影响29
• 3.2 外源性FLAG-HDAC6和FLAG-HDAC6ΔBUZ质粒转染效率检测29-30
• 3.3 蛋白酶体活性抑制时,HDAC6对tau蛋白含量的影响30-31
• 3.4 蛋白酶体活性抑制时,表达外源性HDAC6可促进自噬途径的激活31-32
• 3.5 蛋白酶体活性抑制时,tau与HDAC6的共定位增强及tau蛋白聚集体的形成32-33
• 3.6 蛋白酶体活性抑制时,tau蛋白与HDAC6结合增强33-35
• 4. 讨论35-39
• 4.1 HDAC6对tau蛋白含量的影响35-36
• 4.2 HDAC6对自噬活性的影响36
• 4.3 HDAC6对tau蛋白功能性聚集体形成的影响36-37
• 4.4 HDAC6与tau蛋白的相互作用37-39
• 5. 结论与展望39-41
• 参考文献41-48
• 附录48-49
• 在攻读硕士期间发表的学术论文49-50
• 致谢50

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本文编号：621075