miR-27a作用于Wnt信号通路促进颅咽管瘤钙化的相关研究

发布时间：2017-08-09 02:18

  本文关键词：miR-27a作用于Wnt信号通路促进颅咽管瘤钙化的相关研究

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【摘要】：研究背景及目的颅咽管瘤是由外胚叶形成的颅咽管细胞发展而来的一种常见的胚胎残余上皮源性肿瘤,是儿童颅内最常见的先天性肿瘤,占儿童颅内肿瘤的12-14%,占儿童鞍区肿瘤的50%以上。颅咽管瘤最早是由奥地利的Erdheim教授于1904年首次提出其与胚胎的咽鼓管相关,并将其作为一类单独的鞍区肿瘤进行描述。其后是1932年美国的Cushing教授在书中第一次以”颅咽管瘤”为名称对此类肿瘤进行了比较详细的描述,从而确立了其命名,并一直沿用至今天。颅咽管瘤在病理组织学上属于良性肿瘤(WHO I级),其主要的病理组织类型可分为两种亚型：造釉细胞型颅咽管瘤(adamantinomatous craniopharyngioma ACP)和鳞状乳头型颅咽管瘤(papillary craniopharyngioma PCP),前者好发于儿童患者,多表现为囊性或者囊性为主的囊实性的病变,大多数肿瘤影像学上可见钙化,在儿童患者中钙化出现的比例甚至超过80%,术中可见肿瘤与周围组织粘连严重,而后者以成人多见,实性肿瘤较多,影像学检查罕见钙化,与周围重要结构的炎性粘连也较轻,术后病理资料也证实：造釉细胞型颅咽管瘤多发生钙化,而鳞状乳头型颅咽管瘤基本上不发生钙化。在影响颅咽管瘤手术治疗及预后的众多危险因素当中,钙化是其中较为重要的一个。目前大量临床资料表明,颅咽管瘤的钙化灶常常与肿瘤周围的重要组织结构包括垂体柄、视交叉、三脑室底等粘连紧密,手术中对其完整剥离存在一定困难,增加了肿瘤手术全切除的难度。手术治疗中如果要对颅咽管瘤进行全切除,完整剥离钙化灶,有可能损伤周围重要的组织结构导致患者术后并发症严重,严重影响患者的预后和生活质量,而若不完整剥离粘连的钙化灶,仅对肿瘤行部分切除,则大大增加了患者术后肿瘤的复发率。因此较好的全切除颅咽管瘤并尽量不损伤其周围重要结构一直是神经外科医生面临的难题。经典的Wnt信号传导通路是指由Wnt信号蛋白与细胞表面Frizzled(FZD)受体家族结合而后导致一系列反应,其中β-连环蛋白(β-catenin)是Wnt信号传导通路中的关键因子,β-catenin在细胞质中表达量最多,也可存在于细胞膜及细胞核中。当Wnt信号通路未激活时,存在于细胞质中的β-catenin与APC、AXIN、GSK-3β等蛋白因子形成的降解复合体结合在一起,β-catenin被降解复合体中的因子磷酸化。经磷酸化后的β-catenin随即通过启动的β-转导重复相容蛋白(β-TrCP)介导泛素／蛋白酶体途径在细胞质中被降解。而当Wnt信号通路被激活时,β-catenin从降解复合体中逃离出来并大量在细胞质内积聚,其中一部分可通过核膜孔进入细胞核内与LFF/TCF结合,从而激活下游基因的表达,在肿瘤的发生及多种生物学行为中扮演重要角色。造釉型颅咽管瘤被证实存在β-catenin基因CTNNB1的突变导致Wnt信号通路的激活,而在鳞状乳头型颅咽管瘤中不存在这种突变,Wnt信号通路的激活参与造釉型颅咽管瘤的发生,但其与肿瘤的多种表现包括炎症、钙化、囊肿形成等的关系及作用机理还不十分清楚。小RNA(microRNA,miRNA)是一类非编码蛋白质的单链小RNA分子,由大约22个核苷酸组成,在进化过程中高度保守。miR-27是小RNA家族中功能比较显著的一种,目前发现人类存在有miR-27a、miR-27b两种亚型,大量的研究发现miR-27在人体多种疾病比如乳腺癌、结肠癌、胰腺癌及胃腺癌等肿瘤中的表达较正常组织显著上调,在这些疾病的发生、发展过程中起到重要作用,此外,miR-27在成牙质细胞和成骨细胞分化过程中的起重要作用,可以促进牙质和骨化的形成。并且证实miR-27在人骨髓间充质干细胞(humanmesenchymalstemcells,hMSC)转化为骨细胞的过程中可通过抑制Wnt信号通路中的APC基因的表达,引起细胞质内β-catenin的大量积累而进入细胞核内,激活Wnt信号通路从而影响骨细胞的分化。而下调miR-27表达可促进β-catenin在细胞质中的降解,诱导成骨细胞凋亡,造成骨质疏松。此外,miR-27也可作用于骨成型蛋白信号通路中的BMPR2基因,促进成骨细胞的分化。颅咽管瘤是起源于原始口腔外胚层形成的颅咽管残余上皮细胞,目前组织学上认为造釉细胞型颅咽管瘤与牙源性上皮肿瘤存在较大的相似性,并且牙源性组织所特有的釉质蛋白在造釉细胞型颅咽管瘤中的表达也已得到确认,而在鳞状乳头型颅咽管瘤中则没有发现表达。miR-27可作用于Wnt信号通路引起β-catenin的入核促进牙质的形成和骨细胞的分化,在颅咽管瘤尤其是造釉细胞型颅咽管瘤中miR-27的表达及其与Wnt信号通路的激活对颅咽管瘤钙化形成的作用机理仍不十分明确,有待进一步的研究发现。本研究主要通过检测miR-27a和β-catenin在颅咽管瘤中的表达情况,明确Wnt信号通路的激活与钙化的关系,并且采用上调miR-27a在颅咽管瘤细胞中表达的方法,然后检测Wnt信号通路关键因子β-catenin表达的变化及钙化相关蛋白ALP,BMP2的表达情况,寻找miR-27a作用于Wnt信号通路促进颅咽管瘤钙化的证据,初步探讨颅咽管瘤钙化的形成机制。研究内容与方法1. p-catenin和miR-27a在颅咽管瘤中的表达。收集南方医科大学附属南方医院神经外科2013年4月至2014年10月经病理确诊为颅咽管瘤的标本33例,其中造釉型颅咽管瘤27例,鳞状乳头型颅咽管瘤6例,以上病例均有完整的术前,术后影像学及临床资料。实验方法：采用免疫组化的方法检测不同病理和钙化等级颅咽管瘤标本中β-catenin表达情况,并分析β-catenin表达与病理类型和钙化级别的相关性,进一步运用Westem blot的方法检测颅咽管瘤组织中β-catenin表达水平,分析其表达量与病理类型及钙化级别的相关性；利用RT-PCR的方法检测miR-27a在不同病理类型及钙化级别的颅咽管瘤组织中的表达量,分析其与颅咽管瘤病理类型及钙化级别之间的关系。2. miR-27a通过作用于Wnt信号通路促进颅咽管瘤钙化的初步研究通过上述方法取得的新鲜颅咽管瘤标本,取肿瘤组织的实体部分进行颅咽管瘤细胞的原代培养,得到颅咽管瘤的细胞模型并验证。通过瞬时转染上调miR-27a的颅咽管瘤细胞作为实验组(miR-27a+),设置空白对照组,通过qRT-PCR的方法检测miRNA的表达水平来确认转染成功,相同的条件下培养72小时后进一步采用Westem blot检测每组细胞内β-catenin蛋白和钙化相关蛋白BMP2, ALP的表达水平,最后通过茜素红染色的方法检测每组细胞的钙盐沉积情况,为进一步验证上述试验的结果,取上调miR-27a成功的肿瘤细胞,实验组加入Wnt信号通路阻断剂,相同条件下继续培养72小时,再次通过Western blot的方法验证试验组和空白对照组钙化相关蛋白ALP, BMP2的表达水平。3.统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计学处理。计量资料用x±s表示,组间比较采用两独立样本t检验、不同钙化级别间多重比较采用SNK法(Student-Neuman-Keuls)。以P0.05表示具有统计学差异。结果1. β-catenin和miR-27a在颅咽管瘤中的表达以及其与颅咽管瘤不同病理类型及钙化分级的关系。运用免疫组化方法检测不同颅咽管瘤组织中β-catenin的表达水平,结果显示造釉细胞型颅咽管瘤组织的标本中β-catenin的表达强度高于鳞状乳头型颅咽管瘤,并且造釉细胞型颅咽管瘤组织标本中可见β-catenin在细胞核内表达,其中造釉细胞型颅咽管瘤存在β-catenin细胞核表达细胞常出现于涡旋状细胞及钙化灶区域周边细胞。而鳞状乳头型颅咽管瘤的组织标本中β-catenin多表达于细胞膜上,未发现其在细胞核中表达。进一步采用western blot的方法对所有颅咽管瘤组织中β-catenin的表达进行检测,结果显示造釉型颅咽管瘤组织中β-catenin蛋白的表达水平高于鳞状乳头型颅咽管瘤(P=0.013,0.05)；并且在造釉细胞型颅咽管瘤组织中β-catenin蛋白的表达与钙化的级别有较高的一致性(rs=0.791,P0.001),钙化级别高的颅咽管瘤组织β-catenin蛋白的表达水平也较高,而未见钙化的造釉细胞型颅咽管瘤β-catenin的表达水平和鳞状乳头型颅咽管瘤的表达无统计学意义(P=0.237)。利用qRT-PCR技术检测颅咽管瘤组织中的miR-27a的表达水平,结果显示造釉细胞型颅咽管瘤组织标本中miR-27a的表达水平要高于鳞状乳头型颅咽管瘤(P值为0.024,0.05),并且在造釉细胞型颅咽管瘤组织中miR-27a的表达水平在不同钙化级别分组中的表达差异具有统计学意义(p值均0.05),随着钙化级别的升高,miR-27a的表达水平也升高(rs=0.680,P0.001)。而在未发生钙化的造釉细胞型颅咽管瘤中·miR-27a的表达与在鳞状乳头型颅咽管瘤中的表达差异无统计意义(P值=0.31)。2. miR-27a通过作用于Wnt信号通路促进颅咽管瘤钙化的研究用qRT-PCR进行颅咽管瘤细胞miR-27a的表达检测,转染实验组(miR-27a+)表达水平高于空白对照组,验证转染成功。采用Western blot检测实验组和对照组细胞内β-catenin和钙化相关蛋白BMP2, ALP的表达水平,结果显示实验组细胞内β-catenin和钙化相关蛋白BMP2, ALP的表达水平均高于对照组(P值均0.05)；茜素红染色结果显示实验组的钙盐沉积明显较对照组多.为进一步验证上述试验结果,利用Westem blot检测Wnt信号阻断实验组(Wnt-)和对照组细胞内β-catenin和钙化相关蛋白BMP2,ALP的表达水平,结果显示实验组细胞内钙化相关蛋白BMP2,ALP的表达水平均低于对照组(P值均0.05)。结论miR-27a和Wnt信号通路的激活在颅咽管瘤的钙化过程中扮演了重要的角色。在造釉细胞型颅咽管瘤中miR-27a的表达可促进颅咽管瘤细胞的钙化,这种促进作用是通过作用于Wnt信号通路产生的。阻断Wnt信号通路的激活可以抑制这种促进作用。miR-27a激活Wnt信号通路促进颅咽管瘤细胞的钙化是颅咽管瘤钙化形成的可能机制之一,Wnt信号通路的激活后作用于目的基因促进颅咽管瘤细胞的钙化的具体机制还需要进一步进行研究。
【关键词】：颅咽管瘤 造釉细胞型颅咽管瘤 鳞状乳头型颅咽管瘤 miR-27a Wnt/β-catenin信号通路 钙化
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-21
• 第一章 miR-27a和β-catenin在颅咽管瘤中的表达21-37
• 一 引言21-22
• 二 材料与方法22-31
• 三 结果31-37
• 第二章 miR-27a通过作用于Wnt信号通路促进颅咽管瘤钙化的研究37-50
• 一 引言37
• 二 材料与方法37-46
• 三 结果46-50
• 全文讨论50-54
• 总结54-55
• 参考文献55-61
• 英文缩写词简表61-63
• 攻读学位期间成果63-64
• 致谢64-66

【共引文献】

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本文编号：643101