大鼠大脑局灶性缺血再灌注损伤病理机制及STV保护作用的研究

发布时间：2017-08-10 20:36

  本文关键词：大鼠大脑局灶性缺血再灌注损伤病理机制及STV保护作用的研究

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【摘要】：脑缺血再灌注损伤是一种极为复杂的病理生理过程,涉及到很多种机制,如自由基的生成、兴奋性氨基酸的毒性作用、细胞内钙离子浓度超载等,彼此构成一个互相促进的复杂网络。尽管对脑缺血再灌注损伤机制的研究在不断深入和发展,但是脑缺血再灌注损伤各种机制的枢纽点/交汇点尚不明确,有待于更深入地研究。为了探究缺血/再灌注损伤早中晚期所涉及的级联发病机制及探讨STV对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其相关的保护机制。我们运用改良Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型。采用无创伤的激光多普勒血流仪实施实时的检测,分析大鼠造模前后血流变化值,确保模型构建的可靠性。实时监控大鼠的心率、呼吸频率、血氧饱和度及体温等各项生理指标,排除手术之外的其他因素对动物模型构建造成的影响。对各分组大鼠进行行为学评分。应用脑切片氯化三苯基四氮唑(TTC)染色,最直观的评判脑梗死模型构建的成功与否,同时利用Image J软件来计算梗死面积,表观的衡量STV对脑梗死面积的改善作用。为了探究脑组织蛋白合理有效的分离体系,我们利用不同浓度(10%T,2.6%C或12%T,2.6%C或15%T,2.6%C)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶和4.2%-17.85%T(线性梯度),5%C(交联度)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)为分离系统。利用Western blot蛋白印迹技术检测Thioredoxin 1(Trx1)蛋白、Peroxiredoxin 2(Prx2)蛋白和Heat shock protein 60 kDa(Hsp60)蛋白分别在各组相对应的缺血2 hours/再灌注0 hour/6 hours/22hours/168 hours时间点的表达量,探究STV是否具有神经保护作用及其相关的可能机制。我们成功构建了大鼠脑缺血/再灌注模型,应用脑组织切片的氯化三苯基四氮唑(TTC)染色来评估脑梗死面积,发现STV组跟阳性对照组大鼠的脑梗死面积比手术组减小,同时对于缺血2 hours/再灌注22 hours这个时间点的模型,STV组大鼠比阳性对照大鼠的脑梗死面积大,但是对于缺血2 hours/再灌注168 hours这个时间的模型,STV组大鼠比较阳性对照大鼠的脑梗死面积有所减小。这从一定的程度上说明了,STV对脑缺血组织具有一定的保护作用,且它的长期保护作用更为明显,作用效果强于阳性对照药依达拉奉。我们试验了几种不同浓度(10%T,2.6%C或12%T,2.6%C或15%T,2.6%C)的SDS-PAGE和4.2%-17.85%T(线性梯度),5%C(交联度)SDS-PAGE,最终发现4.2%-17.85%T,5%C的SDS-PAGE对大鼠脑组织蛋白有较好的分离效果。免疫印迹结果表明在缺血2 hours/再灌注0 hour及6 hours时,STV给药组Hsp60表达量减少,说明STV在脑缺血早期能减少脑组织的应激反应。在缺血2 hours/再灌注22 hours,STV组Prx2的表达量明显升高和缺血2 hours/再灌注168 hours模型,Trx1的表达量明显升高,且其表达量也高于阳性对照组。说明Prx2在脑缺血中后期发挥良好的抗氧化作用,防止自由基对脑组织的损害。Trx1在脑缺血后期发挥良好的抗氧化和抗凋亡作用,防止神经元细胞的死亡。在缺血2 hours/再灌注22 hours时,STV组的Prx2的表达量高于同一时期Trx1的表达,说明在缺血2 hours/再灌注22 hours时,STV主要是通过上调Prx2的表达来发挥抗氧化作用。在缺血2 hours/再灌注168 hours时,STV主要是通过上调Trx1的表达来发挥抗凋亡作用。实验结果表明,在脑缺血再灌注损伤的不同时期,STV启动不同的信号通路来保护脑组织。除了上述的工作外,我们还进行了以下的工作。我们结合非变性微型二维凝胶电泳,网格凝胶切取以及定量液相色谱串联质谱(获取数据非依赖型模式,MS~E),用来构建数字化非变性蛋白质谱图,同时,为了改进此研究模式,我们采用了新的质谱串联模式,采用了增强离子淌度分离的数据非依赖模式串联质谱(HDMS~E模式),并将此模式运用到人类血浆蛋白质分析的工作中。即人类血浆样品经过非变性微型二维凝胶电泳分离,将得到的低密度脂蛋白(LDL)所在的长方形区域(18 mm×4.8 mm)切割成72块方形胶粒并将胶粒经过一系列处理后进行定量的液相色谱串联质谱分析(LC-MS/MS)。所得的结果显示,与MS~E相比,HDMS~E表现出更好的分析性能,鉴定所得蛋白质种类数目提高了约50%,并且每种蛋白质在更多的胶粒中被检测到,即对每种蛋白质得到了更全面的谱图。运用LC-HDMS~E,共检测出253种蛋白质,根据每种蛋白质的含量分布信息我们重构了非变性蛋白质谱图。从谱图中,我们可以看到,载脂蛋白B-100(Apo B-100)在凝胶切取区域是含量最丰富的蛋白质,主要分布区域在pI 5.1-6.1,表观分子量在约1000 kDa,即其所在的位置在编号为39-42相对应的四块胶粒中。用我们编写的Excel宏程序去检索蛋白质谱图,结果表明蛋白质的含量峰值落在Apo B-100的集中区域。在252个蛋白质中有22个蛋白质符合此标准,且这22个蛋白质中有19个蛋白质被报道跟LDL相关。这个方法仅仅需要几微升的血浆样品,且蛋白质的分离原理与常用的超速离心法完全不同。这个方法所得到的结果将会使我们对LDL的结构和功能有更深程度的理解。
【关键词】：脑缺血再灌注损伤 大脑中动脉闭塞/再灌注模型 STV Heat shock protein 60 kDa(Hsp60) Peroxiredoxin 2(Prx2) Thioredoxin 1(Trx1) 非变性微型凝胶二维电泳 网格凝胶切取 定量液相色谱串联质谱 非变性蛋白质谱图 低密度脂蛋白
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-14
• 英文缩略词表14-15
• 第一章 绪论15-33
• 1.1 脑卒中现状概述15
• 1.2 脑卒中病理机制及研究现状15-23
• 1.3 脑卒中的药物治疗现状23-25
• 1.3.1 溶栓治疗23-24
• 1.3.2 降纤药物与抗凝药物24
• 1.3.3 抗血小板聚集药物24
• 1.3.4 神经保护治疗24-25
• 1.4 STV及其衍生物研究背景25
• 1.5 蛋白质组学分析方法概述25-27
• 1.5.1 基于蛋白质二维凝胶电泳分离-质谱分析的top-down策略26
• 1.5.2 基于肽段液相色谱分离-质谱分析的bottom-up策略26-27
• 1.6 低密度脂蛋白的概述27-29
• 1.7 本实验研究背景、意义和内容29-33
• 1.7.1 研究背景29-30
• 1.7.2 研究意义30-31
• 1.7.3 研究内容31-33
• 第二章 大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注模型（MCAO/R）构建33-56
• 2.1 引言33-35
• 2.1.1 脑卒中模型的选择及评价33-35
• 2.1.2 大鼠大脑中动脉线栓法构建模型的优势35
• 2.2 实验仪器与材料35-39
• 2.2.1 实验仪器35-36
• 2.2.2 实验材料及相关溶液36-38
• 2.2.3 线栓模型制作准备38-39
• 2.3 实验方法39-46
• 2.3.1 大鼠大脑中动脉局灶性缺血/再灌注模型的制备39-40
• 2.3.2 试验分组和剂量、给药40-41
• 2.3.3 模型成功性验证41-42
• 2.3.4 生理参数检测42-43
• 2.3.5 神经行为学恢复的评估43-44
• 2.3.6 脑组织的切取44-46
• 2.4 结果与讨论46-54
• 2.4.1 血流值测定结果46-50
• 2.4.2 生理参数测定结果50-52
• 2.4.3 脑梗死面积计算结果52-53
• 2.4.4 动物行为学评分结果53-54
• 2.5 本章小结54-56
• 第三章 不同十二烷基硫酸钠-丙烯酰胺凝胶系统（SDS-PAGE）对脑组织蛋白的分离56-72
• 3.1 引言56-57
• 3.2 实验材料与仪器57-58
• 3.2.1 实验材料57
• 3.2.2 实验仪器57-58
• 3.3 实验方法58-63
• 3.3.1 大鼠脑蛋白质的提取及浓度测定58-59
• 3.3.2 不同SDS-PAGE凝胶系统的制备59-62
• 3.3.3 梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶（4.2%-17.85% T（线性梯度），，5% C（交联度））电泳62
• 3.3.4 不同浓度（10% T，2.6% C或 12% T，2.6% C或 15% T，2.6% C）均一SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳62-63
• 3.4 结果与讨论63-71
• 3.4.1 不同系统胶对蛋白分离的影响63-70
• 3.4.2 脑组织蛋白的特点70-71
• 3.5 本章小结71-72
• 第四章 不同时间点MCAO/R模型级联反应过程相关蛋白表达及量的变化72-97
• 4.1 引言72-74
• 4.2 实验材料与仪器74-75
• 4.2.1 实验材料74
• 4.2.2 实验仪器74-75
• 4.2.3 相关溶液的配制75
• 4.3 实验方法75-79
• 4.3.1 水溶性蛋白质的提取及浓度测定75-76
• 4.3.2 大鼠脑组织蛋白质的一维十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳76-77
• 4.3.3 大鼠脑组织蛋白质的免疫印迹法77-79
• 4.3.4 统计学分析79
• 4.4 结果与讨论79-96
• 4.4.1 脑缺血过程中氧化应激相关蛋白的分析79-84
• 4.4.2 相关蛋白不同时间点表达量的变化的所涉及的级联反应84-89
• 4.4.3 STV与依达拉奉的比较89-96
• 4.5 本章小结96-97
• 第五章 使用数字化非变性蛋白图谱方法分析低密度脂蛋白（LDL）及其相关蛋白97-117
• 5.1 引言97-98
• 5.2 实验材料与仪器98-100
• 5.2.1 实验材料98-100
• 5.2.2 实验仪器100
• 5.3 实验方法100-108
• 5.3.1 血浆样品的准备100-101
• 5.3.2 人血浆蛋白的非变性二维凝胶电泳101-103
• 5.3.3 凝胶网格切取103-104
• 5.3.4 胶内酶解104-105
• 5.3.5 纳升级超高效液相色谱分离105-106
• 5.3.6 质谱对肽段样品的定性定量分析106
• 5.3.7 数据处理及蛋白质的鉴定和定量分析106-107
• 5.3.8 重构非变性蛋白图谱107-108
• 5.4 实验结果与讨论108-116
• 5.4.1 MS~E模式与HDMS~E模式的比较108
• 5.4.2 Apo B-100 的分布及网格切取区域其他主要的血浆蛋白108-111
• 5.4.3 运用数字化蛋白质谱图进行低密度脂蛋白相关蛋白搜索111-113
• 5.4.4 已报道的LDL相关蛋白结果的比较113-114
• 5.4.5 数字化天然蛋白图谱在分析LDL结合蛋白的特征114-116
• 5.5 本章小结116-117
• 结论与展望117-121
• 结论117-118
• 创新点118-119
• 展望119-121
• 参考文献121-132
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果132-133
• 致谢133-134
• 附件134

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