嘌呤能受体P2Y12基因对EAE发病的影响及其机制研究

发布时间：2017-08-12 08:26

  本文关键词：嘌呤能受体P2Y12基因对EAE发病的影响及其机制研究

  更多相关文章： P2Y12 EAE CD4~+T细胞 树突状细胞

【摘要】：自身免疫性疾病(Autoimmune disease, AID)是指机体由于异常识别自身组织抗原而发动免疫攻击,致使正常组织发生损伤或病变的一类疾病。多发性硬化症(Multiple Sclerosis, MS)是一种重要的自身免疫性疾病,主要由CD4+T细胞介导、以脊髓和脑两大神经中枢系统的轴突脱髓鞘为主要特征的神经退行性疾病。虽然对MS开展了很多的研究,但是其发病机理一直是人们迫切期望解答的重要问题。实验性变态反应性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE)是在基础研究中广泛使用的经典小鼠模型,很好地模拟了MS病人的临床表型和病理特征,具有方法成熟、临床表型明显和评分标准规范化等优点。P2Y12受体属于嘌呤类P2Y受体家族的一员,由于其在血小板上的重要作用而受到广泛关注。同时,P2Y12受体是拥有七次跨膜结构的G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors, GPCR)。GPCR受体参与调控机体多种生物学功能,并参与下游多种细胞信号转导过程。已有实验证明P2Y12受体基因在MS发病患者上表达发生改变,但该基因是否与MS的发病具有相关性尚不明确。因此本课题主要利用P2Y12受体基因敲除小鼠构建EAE模型,探讨P2Y12受体与MS/EAE发病之间的关系。在本研究中,我们发现P2Y12基因在EAE发病小鼠脾脏中的表达水平明显低未发病小鼠。通过构建野生型和敲除型小鼠EAE模型,发现从临床评分、病理表型和CD4+T细胞亚群等指标上看,相比于野生型小鼠,P2Y12基因敲除后EAE发病都更为严重。由于EAE主要是由CD4+T细胞介导的疾病,于是我们体外分离了野生型和敲除型小鼠脾脏中的naive CD4+ T细胞,结果表明P2Y12缺失并不影响CD4+T细胞的体外分化和增殖活化。为了进一步探讨P2Y12影响EAE的发病机制,我们在体外诱导了骨髓来源的树突状细胞(BMDC),对DC细胞因子的分泌、表面分子的表达和Th细胞诱导等方面进行了分析。结果表明,相比于野生型DC,P2Y12基因缺失DC可以分泌更多的TGF-β和IL-23p19,同时DC表面分子CD40、CD86和MHCⅡ类分子表达也明显升高。从流式染色结果看出,P2Y12基因缺失DC的培养上清会促进naive CD4+ T细胞向Th17方向进行分化。综上所述,P2Y12基因缺失使DC的功能发生异常,改变EAE小鼠体内CD4+T细胞亚群的比例,加剧EAE小鼠发病进程。该研究提示我们P2Y12可能是EAE治疗的一个潜在靶标,同时也为临床上P2Y12抑制剂的使用提供了相应的指导依据。
【关键词】：P2Y12 EAE CD4~+T细胞 树突状细胞
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R744.51
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章 前言12-21
• 1. 自身免疫性疾病12-15
• 1.1 概述12-13
• 1.2 自身免疫性疾病的决定因素13-15
• 2. 免疫细胞15-17
• 2.1 免疫异常与AID的关系15-16
• 2.2 多发性硬化症中的免疫细胞16-17
• 3. 嘌呤类受体17-18
• 3.1 概述17-18
• 3.2 嘌呤受体与MS的关系18
• 4. 树突状细胞18-20
• 4.1 树突状细胞与EAE19
• 4.2 树突状细胞与银屑病19-20
• 4.3 树突状细胞与Ⅰ型糖尿病20
• 4.4 树突状细胞和系统性红斑狼疮20
• 结语20-21
• 第二章 P2Y12基因对EAE小鼠发病影响的研究21-38
• 引言21-22
• 材料22-25
• 1. 实验动物22
• 2. 主要试剂22-23
• 3. 实验器材23
• 4. 主要仪器23
• 5. 试剂配制23-25
• 方法25-32
• 1. P2Y12基因敲除小鼠繁殖与鉴定25-27
• 2. EAE动物模型的构建及评分27
• 3. 小鼠脊髓组织取材以及病理染色27-30
• 4. 脾淋巴细胞的分离与流式检测30
• 5. 小鼠血清分离和细胞因子ELISA检测30-32
• 结果32-36
• 1. P2Y12基因在EAE小鼠中表达水平的检测32
• 2. P2Y12基因敲除EAE小鼠的临床评分32-33
• 3. P2Y12基因敲除EAE小鼠的病理学分析33-34
• 4. P2Y12基因敲除EAE小鼠脾细胞亚群的检测34-35
• 5. P2Y12基因敲除EAE小鼠血清中细胞因子表达的检测35-36
• 讨论36-38
• 第三章 P2Y12基因对CD4~+T细胞功能影响的研究38-51
• 引言38
• 材料38-41
• 1. 实验动物38-39
• 2. 主要试剂39
• 3. 实验器材39
• 4. 主要仪器39
• 5. 试剂配制39-41
• 方法41-44
• 1. 脾脏中T细胞及其亚群的检测41-42
• 2. Naive CD4~+T细胞分选及体外分化42-43
• 3. Naive CD4~+T细胞体外增殖43-44
• 结果44-49
• 1. P2Y12基因缺失小鼠的T细胞亚群检测44-47
• 2. P2Y12基因缺失对CD4~+T细胞体外分化的影响47-48
• 3. P2Y12基因缺失对CD4~+T细胞增殖能力的影响48-49
• 讨论49-51
• 第四章 P2Y12基因对树突状细胞功能影响的研究51-64
• 引言51-52
• 材料52-53
• 1. 实验动物52
• 2. 主要试剂52
• 3. 实验器材52
• 4. 主要仪器52-53
• 5. 试剂配制53
• 方法53-58
• 1. 小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)的制备和纯度检测53-54
• 2. BMDC细胞因子表达水平的检测54-57
• 3. BMDC表面分子的检测57
• 4. BMDC培养上清和CD4~+T细胞共培养实验57-58
• 结果58-62
• 1. 骨髓来源树突状细胞BMDC纯度的检测58
• 2. P2Y12基因缺失对DC表面分子表达的影响58-59
• 3. P2Y12基因缺失对DC细胞因子表达的影响59-60
• 4. P2Y12基因缺失对DC诱导的CD4~+T细胞分化的影响60-62
• 讨论62-64
• 结论64-65
• 参考文献65-77
• 综述77-88
• 参考文献83-88
• 致谢88

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本文编号：660661