CDNF修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森病的实验研究

发布时间：2017-08-12 12:09

  本文关键词：CDNF修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森病的实验研究

  更多相关文章： 大鼠 帕金森病 BMSCs CDNF 基因治疗

【摘要】：大脑多巴胺能神经营养因子(CDNF)作为一种新型保守神经营养因子,对多巴胺能神经元具有特异性的保护和修复作用。帕金森病的主要病理变化就是多巴胺能神经元的减少。已有研究表明,骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为一种多功能干细胞,移植入帕金森病模型大鼠之后,能在脑内迁移、分化为神经元样细胞,对帕金森病具有一定程度的治疗作用。而作为神经营养因子的CDNF是否可以改善细胞移植治疗的效果,是值得研究的课题。本实验在探讨PD的发生发展与CDNF表达量变化的基础上,尝试以CDNF基因修饰BMSCs,研究转染CDNF基因的BMSCs (CDNF-BMSCs)移植对PD的治疗效果。目的：为了探讨大脑多巴胺能神经营养因子(CDNF)与帕金森病(PD)发病之间的关系,以及以CDNF修饰的BMSCs移植治疗PD的效果,对PD模型大鼠脑内CDNF的表达变化及转CDNF基因BMSCs移植治疗PD大鼠模型的作用及其机理进行研究。为临床基因治疗帕金森病提供实验依据。方法：(1)使用大鼠脑立体定位仪,单侧纹状体内单点注射6-羟多巴胺制备帕金森病模型,术后三周腹腔注射阿扑吗啡诱导大鼠旋转行为,筛选成功模型。免疫组织化学法、Western blot (WB)及Q-PCR检测CDNF在帕金森病大鼠模型黑质纹状体中的表达情况,并以Western blot及免疫组织化学法检测相应的TH表达变化。(2)构建真核表达质粒载体,采用Lipo 2000将重组真核表达质粒pCDNA3.1 (+)-CDNF转染至BMSCs,免疫细胞化学检测BMSCs体外表达CDNF情况。使用p-巯基乙醇体外诱导CDNF-BMSCs定向分化为神经元样细胞,探讨基因修饰BMSCs的分化以及分化后表达CDNF蛋白的潜能。(3)将成功PD模型大鼠分为模型对照组、BMSCs移植组和CDNF-BMSCs移植组三组。根据实验设计,模型对照组、BMSCs移植组和CDNF-BMSCs移植组的大鼠脑纹状体内分别定位注射PBS (10μl)、BMSCs (10μl, 1×104 个/μl细胞)、CDNF-BMSCs (10μ1,1×104个/μ1细胞)。分别在治疗后2周、5周、8周阿扑吗啡诱导,检测旋转行为的改变；并于上述时间点分别取大鼠纹状体,以免疫组织化学、WB技术检测CDNF及相应TH的表达变化,分析比较治疗效果及其作用机理。结果：(1)对PD模型大鼠脑组织细胞学和相关蛋白表达的研究,免疫组织化学实验结果发现模型大鼠脑黑质区CDNF、TH阳性细胞数明显减少；WB实验的结果发现模型组大鼠脑的CDNF和TH蛋白表达量极显著低于对照组(p0.01,n=10)；Q-PCR分析表明正常组与模型组间CDNF mRNA表达水平间不存在显著差异(p0.05,n=5)。本研究显示PD模型大鼠CDNF mRNA表达水平与正常大鼠组之间虽无显著性差异,但多巴胺合成相关酶及营养因子蛋白表达却降低。其原因可能是由于影响CDNF蛋白翻译或翻译后修饰的某些因素的水平发生变化,导致蛋白降低。(2)对重组载体的酶切和测序结果显示,本实验成功构建了CDNF重组载体,且转染CDNF基因的BMSCs成功表达CDNF蛋白；体外实验中,CDNF基因修饰的BMSCs,经β-巯基乙醇诱导可以分化为神经元样细胞。说明基因修饰并不影响BMSCs的分化潜能,且分化后的细胞仍能表达CDNF蛋白。(3)细胞移植治疗PD模型大鼠的实验显示,移植治疗2周后,CDNF-BMSCs组的行为学改善显著优于BMSCs组(P0.05,n=10)；移植5周后,CDNF-BMSCs组和B MSCs组动物的行为学改善均极显著优于对照组(P0.01,n=10)。WB结果显示：移植治疗2周后,(DNF-BMSCs组动物的CDNF蛋白表达量极显著高于BMSCs组(P0.01,n=5)；CDNF-BMSCs组TH蛋白表达量显著高于BMSCs组(P0.05,n=5)。免疫组织化学法检测TH、CDNF阳性的结果显示,CDNF-BMSCs组和BMSCs组动物脑纹状体内CDNF、TH阳性细胞数均随时间逐渐增多(n=5)。实验结果说明,BMSCs和CDNF-BMSCs移植治疗PD模型大鼠后,大鼠的行为学得到了改善,多巴胺神经元的结构与功能部分恢复,且治疗前期使用CDNF-BMSCs的移植治疗效果明显优于单独移植BMSCs。结论：本研究运用大鼠模型,通过WB、免疫组织化学、Q-PCR三种检测方法对帕金森病的发生发展与CDNF表达量的关系进行了探讨,发现帕金森病的发病与纹状体CDNF蛋白表达量的降低有关。本研究构建了CDNF真核表达质粒载体、成功修饰了BMSCs,在体外可以表达CDNF蛋白；CDNF-BMSCs脑内移植治疗后,在一定时间内能显著提高BMSCs移植治疗PD模型大鼠的效果。研究结果提示,CDNF可以作为基因治疗PD的候选基因,该实验为基因治疗帕金森病提供了实用的技术途径。
【关键词】：大鼠 帕金森病 BMSCs CDNF 基因治疗
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.5
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 符号说明9-10
• 第一部分 文献综述10-22
• 1 帕金森病发病机制10-11
• 2 PD治疗方法的概述11-12
• 3 基因治疗PD的研究现况12-17
• 参考文献17-22
• 第二部分 研究论文22-63
• 第一章 帕金森病模型大鼠脑内CDNF的水平的研究22-37
• 1 实验材料22-24
• 2 实验方法24-28
• 3 实验结果28-32
• 4 讨论32-34
• 参考文献34-37
• 第二章 CDNF表达载体的构建及体外表达37-53
• 1 实验材料37-39
• 2 实验方法39-44
• 3 实验结果44-48
• 4 讨论48-50
• 参考文献50-53
• 第三章 CDNF基因修饰的BMSCs移植治疗PD大鼠的研究53-63
• 1 实验材料53-55
• 2. 实验方法55-57
• 3 实验结果57-60
• 4 讨论60-62
• 参考文献62-63
• 全文小结63-64
• 致谢64
• 攻读硕士学位期间发表的主要论文64-65

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本文编号：661502