MCM5在后脑面部运动神经元发育中的作用及调控机制的初步研究

发布时间：2017-08-14 11:40

  本文关键词：MCM5在后脑面部运动神经元发育中的作用及调控机制的初步研究

  更多相关文章： 微小染色体维持蛋白 mcm5 面部运动神经元 FGF信号通路 胚胎发育

【摘要】：目的微小染色体维持蛋白(MCM5,minichromosome maintenance proteins5)是微小染色体维持蛋白家族中的一员,在DNA的复制起始和延伸中扮演着重要的角色。MCM5表达量远大于细胞周期中DNA复制所必需的量,提示MCM5可能在胚胎发育中参与了DNA复制以外其他功能调控。mcm5可以通过参与DNA复制起始、延伸以及调控特定基因的转录影响生物的发育。本研究利用Morpholino方法降低mcm5的表达,观察mcm5缺失对后脑面部运动神经元发育的影响,以及mcm5影响后脑面部运动神经元发育的作用机制。本项目研究结果有助于对后脑面部运动神经元发育分子调控机制的理解,为后脑面部运动神经元发育缺陷所致面部运动性疾病的治疗研究,提供理论依据,同时也加深人们对细胞周期因子MCM5在细胞周期与细胞分化中双重作用的认识。方法采用Morpholino方法敲降mcm5,在胚胎发育到13hpf(hours post fertilizer),31hpf,48hpf利用解剖显微镜拍摄记录,观察胚胎外观发育。胚胎发育到48hpf时,运用islet1抗体整胚免疫荧光显色方法,标记后脑面部运动神经元。使用激光共聚焦拍摄记录后脑面部运动神经元的发育。整胚原位杂交检测mcm5功能性敲降后,胚胎发育到13体节时,FGF信号通路相关分子的表达。采用TUNEL染色法观察mcm5功能敲降后,胚胎发育到48hpf时后脑细胞的凋亡。pH3抗体整胚免疫荧光显色法,观察胚胎发育到48hpf时,后脑细胞的增殖变化。实时荧光定量PCR(染料法),检测凋亡相关基因,增殖相关基因的表达。构建fgfr1a-pcs2+载体,体外转录制备正义mRNA,观察fgfr1a mRNA是否可以援救mcm5 MO引起的后脑面部运动神经元发育缺陷。结果(1)当mcm5表达降低时,后脑脑室变小、中脑-后脑边缘模糊。Islet1抗体整胚免疫荧光显色,发现mcm5功能敲降后,后脑面部运动神经元不能正常迁移。制备mcm5mrna与mcm5mo在胚胎一细胞期共同注射,发现mcm5mrna能够回救mcm5mo造成的影响。说明mcm5特异的调控了后脑的发育与后脑面部运动神经元的迁移。(2)mcm5功能性敲降后,fgf信号通路中配体fgf8表达升高,受体fgfr1a及其下游分子pea3表达降低。mcm5mrna能够援救由于mcm5mo敲降所引起的fgf信号通路相关分子表达紊乱。通过tg(hsp70:dnfgfr-gfp)转基因鱼,将其胚胎在80%原肠外包时热激表达dnfgfr-gfp(非功能性的fgfr)以竞争性降低fgfr活性发现,当fgfr活性降低后,fgf8和pea3表达分别上升和降低,这表明fgfr信号活性降低反向调控导致fgf8表达增加。实验证实mcm5在胚胎后脑发育过程中调控了fgf信号活性,并且是在fgf信号途径受体或更下游层次上调控fgf信号。(3)mcm5功能性敲降后,tunel染色发现后脑细胞凋亡无明显变化,凋亡相关基因表达变化不具有统计学意义。说明mcm5可能并不通过调控细胞凋亡,影响后脑面部运动神经元的发育。(4)mcm5功能性敲降后,后脑增殖细胞减少,增殖相关基因表达下降,且mcm5mrna能够援救mcm5mo造成的缺陷。说明mcm5可能通过调控细胞增殖,参与后脑面部运动神经元的发育。(5)fgfr1amo能够模拟mcm5mo对后脑面部运动神经元造成的发育缺陷,并且fgfr1amo造成的后脑面部运动神经元的发育缺陷更为严重,不仅面部运动神经元迁移困难,而且神经元数量减少。制备fgfr1amrna与mcm5mo在胚胎一细胞期共注射,发现fgfr1amrna能够援救mcm5造成的面部运动神经元迁移困难,而mcm5mrna不能援救fgfr1amo引起的面部运动神经元的发育缺陷。结合第二部分实验数据可知,mcm5通过对fgfr1a表达的调控,影响后脑面部运动神经元的发育。结论mcm5表达降低,导致胚胎后脑脑室变小,中脑-后脑边缘模糊,后脑面部运动神经元迁移困难,但后脑细胞凋亡并未增加,凋亡相关基因表达也无明显变化。然而mcm5功能敲降后,后脑细胞增殖减少,增殖相关基因表达降低。FGF信号通路中配体fgf8表达升高,fgfr1a,pea3表达降低。特异敲降fgfr1a,能够模拟mcm5表达降低后,后脑面部运动神经元造成的发育缺陷,并且fgfr1a MO造成的后脑面部运动神经元的发育缺陷更为严重,不仅面部运动神经元迁移困难,而且神经元数量减少。制备fgfr1a mRNA与mcm5MO在胚胎一细胞期共注射,发现fgfr1a mRNA能够援救mcm5造成的面部运动神经元迁移困难,而mcm5 mRNA不能援救fgfr1a MO引起的面部运动神经元的发育缺陷。以上结果均表明mcm5并不通过调节细胞凋亡影响后脑面部运动神经元的发育。而是通过影响细胞的增殖,以及调节FGF信号通路中fgfr1a的表达,参与对后脑面部运动神经元发育的调节。
【关键词】：微小染色体维持蛋白 mcm5 面部运动神经元 FGF信号通路 胚胎发育
【学位授予单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R741
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-16
• 第一部分 MCM5在后脑面部运动神经元发育中的作用16-24
• 1 引言16-17
• 2 材料与方法17-20
• 2.1 实验动物及饲养17
• 2.2 试剂、耗材和仪器17-18
• 2.3 培养基和主要试剂的配制18-19
• 2.4 实验方法19-20
• 3 实验结果20-23
• 3.1 mcm5基因功能敲降导致后脑发育异常20-21
• 3.2 mcm5 mRNA援救mcm5 MO导致的后脑面部运动神经元发育缺陷21-23
• 4 讨论23
• 5 小结23-24
• 第二部分 MCM5可能不经凋亡途径调控后脑面部运动神经元的发育24-31
• 1 引言24
• 2 材料与方法24-28
• 2.1 实验动物及饲养24
• 2.2 试剂、耗材和仪器24
• 2.3 实验方法24-28
• 3 实验结果28-29
• 3.1 mcm5功能敲降，后脑面部运动神经元凋亡未增多28
• 3.2 凋亡相关基因表达水平无明显变化28-29
• 4 讨论29-30
• 5 小结30-31
• 第三部分 MCM5可能通过细胞增殖调控后脑面部运动神经元发育31-36
• 1 引言31
• 2 材料与方法31-33
• 2.1 实验动物及饲养31
• 2.2 试剂、耗材和仪器31-32
• 2.3 实验方法32-33
• 3 实验结果33-34
• 3.1 mcm5功能性敲降后，后脑增殖细胞减少33-34
• 3.2 增殖相关基因表达异常34
• 4 讨论34-35
• 5 小结35-36
• 第四部分 FGF信号介导MCM5调控后脑面部运动神经元发育36-51
• 1 引言36-37
• 2 材料与方法37-44
• 2.1 实验动物及饲养37
• 2.2 试剂、耗材和仪器37
• 2.3 原位杂交相关试剂的配制37-38
• 2.4 实验方法38-44
• 3 实验结果44-48
• 3.1 mcm5 mRNA援救由mcm5 MO所引起的FGF信号通路异常44-46
• 3.2 FGFR1A功能下调反向调控增加fgf8表达46-47
• 3.3 fgfr1a MO模拟了mcm5MO所致的后脑面部运动神经元发育缺陷47
• 3.4 fgfr1amRNA援救mcm5MO所致后脑面部运动神经元发育缺陷47-48
• 4 讨论48-49
• 5 小结49-51
• 全文总结51-53
• 参考文献53-57
• 文献综述57-66
• 参考文献63-66
• 附录66-67
• 攻读硕士学位期间研究成果67-68
• 致谢68

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本文编号：672497