UGT1A6单核苷酸多态性与缺血性卒中患者阿司匹林低反应性的关联性研究

发布时间：2017-08-15 03:10

  本文关键词：UGT1A6单核苷酸多态性与缺血性卒中患者阿司匹林低反应性的关联性研究

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【摘要】：脑卒中是全球最常见的慢性疾病之一,其高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率的特点,不仅损害患者身心健康和生活质量,而且给家庭和社会带来了沉重的经济负担。通过全社会的积极干预,全球范围内的卒中死亡率在过去几十年已有下降趋势,但是对于中国这样的发展中国家,卒中患病率、死亡率仍居高不下。最新的“全球疾病负担报告2013”显示,卒中已成为我国居民第一死亡原因和第一致残原因。中国已成为名副其实的世界第一卒中大国,由于缺血性卒中是脑卒中最常见的类型,因此缺血性卒中的防治工作尤为重要。阿司匹林(aspirin)又名乙酰水杨酸(acetylsalicylic acid, ASA),其使用历史已经有数千年,早在希波克拉底时代就有记载,当时的人们使用柳树皮来解热镇痛。1800年人们从柳树皮中提炼出其具有解热镇痛作用的有效成分——水杨酸(salicylic acid, SA)。为了减轻胃肠道副作用,无数化学家努力钻研,直到1898年德国化学家Felix Hoffman才成功合成了较为纯净的且对胃肠道副作用较小的乙酰水杨酸,1899年德国拜耳公司正式生产该药,并命名为阿司匹林。阿司匹林应用于临床也有数百年历史,它不仅具有解热镇痛、消炎、抗风湿等功效,还能防止血栓形成和抗恶性肿瘤等。但是早期,人们主要运用其消炎、解热、镇痛的功效,直到1971年英国药理学家John Vane发现阿司匹林可以抑制环氧合酶(cyclooxygenase, COX),进而抑制血栓烷素A2(thromboxane A2, TXA2)及前列腺素(prostaglandin, PGs)的生成,发挥抗血小板聚集及止痛抗炎的功效。1980年,美国食品及药品监督管理局(FDA)批准阿司匹林用于卒中患者的二级预防。从此,阿司匹林被广泛用于缺血性心脑血管疾病的防治中。阿司匹林是目前全球应用最广泛的药物之一,作为缺血性脑血管病一、二级预防的基石,其消费量在国内及全球都呈逐年上涨趋势。阿司匹林抗血小板聚集的分子机制是不可逆的乙酰化COX-1的第529位丝氨酸,改变酶的空间构象,使其空间位阻增大,导致花生四烯酸难以进入疏水口袋发生反应,从而抑制花生四烯酸(Arachidonic acid, AA)生成具有激活血小板、促进血小板聚集功能的TXA2。由于阿司匹林对COX-1的抑制是不可逆的,所以其抗血小板聚集功能将持续血小板约7-14天的生命周期。临床中抗血小板聚集、预防血管内血栓形成主要使用小剂量(75mg-100mg/日)阿司匹林。循证医学证实,阿司匹林是一种有效的缺血性卒中预防用药,可使缺血性脑卒中的年发生风险降低约25-30%。但是遵医嘱服用阿司匹林的卒中患者中仍有部分人群发生缺血性事件或血小板聚集率较高,这种现象被称作“阿司匹林低反应性”(aspirin low responsiveness, ALR)..“阿司匹林反应性差异”(aspirin responsive variation)或“阿司匹林抵抗”(aspirin resistance, AR)。阿司匹林抵抗又分为临床抵抗和实验室抵抗,主要包括：接受阿司匹林治疗后仍然发生血栓事件；不能抑制通过血小板COX-1介导的TXA2形成过程；不能延长出血时间；体外或体内血小板功能检测中,不能达到预期的效果。研究显示阿司匹林低反应性具有重要的遗传背景。药物遗传学及药物基因组学证实,遗传背景不同的人其血小板对阿司匹林的反应性存在明显差异。研究显示,阿司匹林的药物作用酶,如环氧合酶-1、环氧合酶-2、血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体、二磷酸腺苷受体P1Y1及P2Y12的基因多态性,可能使得某些患者或人群更容易发生阿司匹林低反应性。但是,目前关于阿司匹林代谢酶的基因多态性与阿司匹林低反应性之间的关联性研究甚少。肝脏内存在众多药物代谢酶,包括催化氧化、还原、水解的Ⅰ相代谢酶,和催化各种结合反应的Ⅱ相代谢酶,结合反应主要包括乙酰化,甲基化、硫酸化,葡萄糖醛酸化等。Ⅱ相生物转化是将药物或Ⅰ相代谢产物的极性基团与内源性物质结合,生成的极性增加、活性降低、易于排出的结合物。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(uridine diphosphate glucuronosyltransferase enzymes, UGTs),是最重要Ⅱ相药物代谢酶,它可以催化多种药物与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(Uridine diphosphoglucuronic acid, UDPGA)结合,使UDPGA上的葡萄糖醛酸基(GA)与药物结构中的功能基团结合,生成含葡萄糖醛酸基的结合物。UGT所催化的葡萄糖醛酸结合反应受到亚族酶的表达水平和功能状态的双重调节,其单核苷酸多态性可能改变酶的表达和活性。UGT是一个高度固定化的微粒体酶系,是一个庞大的超家族,目前共发现35种以上葡萄糖醛酸基转移酶,人类目前至少发现19种。其中,UGT1A6主要催化阿司匹林代谢,代谢产物为水杨尿酸(salicyluric acid, SUA)和葡萄糖醛酸基的结合物(salicylic acid phenolic glucuronide, SAPG). UGT1A6的多态性位点可能导致阿司匹林药物代谢率变化以及治疗效果发生变化。Nagar S等发现rs6759892,rs2070959,rs1105879以及其单倍体型UGT1A6*2可能影响UGT1A6酶活性。另外两个研究表明,JGT1A6*2个体的酶活性较野生型个体低,导致阿司匹林醛酸化率降低。表明UGT1A6基因单核苷酸多态性可能影响阿司匹林代谢水平,但目前尚无关于UGT1A6单核苷酸多态性与阿司匹林低反应性的关联性研究。我们猜想,如果筛选出与阿司匹林低反应性相关的这些多态性位点,那么利用基因检测初步筛选出携带易感基因的人群,通过改变他们抗血小板药物、联合用药、改变药物剂量等制定个体化的抗血小板治疗方案,以降低阿司匹林低反应性所引起的再发缺血性脑卒中或脑出血等并发症,并提高抗血小板治疗的效果,改善患者预后。研究目的：UGT1A6是催化阿司匹林醛酸化的最主要的Ⅱ相药物代谢酶。其基因UGT1A6的多态性在阿司匹林代谢中扮演着重要角色。但是截至目前,鲜有研究关注UGT1A6单核苷酸多态性与个体间阿司匹林反应性差异的相关性。我们设计此研究想要明确UGT1A6基因单核苷酸多态性与中国汉族缺血性脑卒中患者阿司匹林低反应性之间是否存在相关性。研究方法：本研究选择了从2011年9月到2014年10月在南京卒中注册系统注册的缺血性卒中患者。纳入标准：首发缺血性卒中患者；汉族,年龄大于等于18岁；在卒中发作后48小时内服用过阿司匹林；患者在血栓弹力图测量血小板功能之前,至少规律服用阿司匹林(100mg/d)7天；同意入组研究。排除标准：同时应用华法林、肝素或其它抗凝药物的患者；长期服用(大于3次／周)其它非甾体类抗炎药(NSAIDs)的患者；存在严重肝脏疾病和(或)肾脏疾病的患者：有恶性肿瘤患者。本研究经南京军区总医院伦理委员会认可,所有参与者均签署知情同意书。入院时收集并记录所有患者的基本信息：年龄、性别、体质指数、收缩压、舒张压、入院NIHSS评分及出院mRS评分。临床资料：高血压、糖尿病、吸烟、饮酒情况。入院后第二天清晨空腹抽取外周静脉血,检测血液指标并留存提取DNA的血样。患者入院后规律服用阿司匹林(100mg/d)7天,使用TEG血小板图系统(TEG 5000, Haemonetics公司,马萨诸塞州,美国),检测血小板功能,即花生四烯酸诱导的血小板抑制率(AA%)。基因分型采用iLMDR技术,由上海天昊生物科技有限公司提供技术支持。设立空白对照样本和10%重复样本以评估分型结果的可靠性。数据通过SPSS 19.0 (Armonk, NY:IBM Crop.)进行处理,P0.05为差异有统计学意义。连续资料用χ±s或中位数及四分位间距(inter quartile range, IQR)表示,组间比较采用t检验或Mann-Whitney U检验分析；分类资料以频数和率表示,组间比较采用x2检验。采用goodness-of-fit x-检验比较多态性位点基因型分布频率,以判断Hardy-Weinberg平衡吻合度。3个单核苷酸多态性间的连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)采用Haploview4.2软件(http://www.broad,mit.edu/mpg/haploview/)进行分析。采用广义线性模型分析多态性位点与阿司匹林反应性之间的相关性,各位点分别按显性、隐性、加性遗传模型分别分析。在广义线性模型分析中,血小板抑制率(AA%)为因变量,吸烟、收缩压、总胆固醇作为广义线性模型的调节变量。单倍体型分析采用的是PHASE 2.1软件。研究结果：本研究共纳入323例缺血性卒中患者,其中253(78.3%)例为男性；年龄的中位数四分位间距为63.0(55.0-70.0)岁；其中255(78.9%)例患者有高血压；105(32.5%)例患者患有糖尿病；151(46.7%)例患者吸烟。本研究3个位点基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P0.05)。其最小等位基因频率(MAF)分别为：rs6759892(25.7%),rs2070959(23.1%),rs1105879(25.7%)。本研究三个SNP最小等位基因频率与人类基因组单倍体型图(HapMap)数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)相符。中国北京汉族人群各位点的最小等位基因频率相近,CHB-MAF分别为rs6759892(26.3%),rs2070959(24.6%),rs1105879(26.3%)。广义线性模型分析发现,rs2070959的显性模型(β=0.084±0.032,P=0.010)和加性模型(β=0.060±0.028,P=0.033)都与血小板抑制率呈显著的正相关。男性患者中也呈现了这种相关性,显性模型(β=0.098±0.036,P=0.006),加性模型(β=0.072±0.031,P=0.024)。当用进一步用Bonferroni校正进行多重比较后,rs2070959的显性模型仍然与阿司匹林反应性显著相关,所有患者的校正后P值,P校正=0.029,男性患者的校正后P值,P校正=0.019。但是在女性患者中,未发现显著相关(β=0.040±0.075,P=0.597)。这些结果表明,SNPrs2070959基因型为GA和GG的患者可能比基因型为AA的患者对阿司匹林更敏感,尤其是在男性患者中。结论：SNP位点rs20709595的突变等位基因G与所有患者的阿司匹林反应性相关,这种关系在男性患者中尤其显著。而SNP位点rs6759892、rs1105879仅在男性患者中观察到了相关性。因此检测与阿司匹林代谢相关的基因或实验室检测血小板功能可能有利于临床医师为缺血性卒中患者制定个体化抗血小板治疗方案。
【关键词】：缺血性脑卒中 阿司匹林低反应性 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3
【目录】：

• 中文摘要3-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13-27
• 参考文献23-27
• 1.1 引言27-29
• 1.2 研究对象与方法29-31
• 1.3 全基因组DNA的提取和基因型的检测31-34
• 1.4 血小板功能测定34-37
• 1.5 统计分析37
• 1.6 结果37-40
• 1.7 讨论40-43
• 参考文献43-45
• 综述45-55
• 参考文献52-55
• 附录/缩略词表55-56
• 硕士在读期间成果56-57
• 致谢57-58

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1 顾健腾,陶国才,鲁开智,文欣荣;无肝期大鼠小肠异丙酚代谢相关UGT1A6的基因表达变化[J];重庆医学;2005年09期

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1 刘柯婷;UGT1A6单核苷酸多态性与缺血性卒中患者阿司匹林低反应性的关联性研究[D];南方医科大学;2016年

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本文编号：675970