单唾液酸四己糖神经节苷脂体外定向诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞及其机制的研究

发布时间：2017-08-16 22:24

  本文关键词：单唾液酸四己糖神经节苷脂体外定向诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞及其机制的研究

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【摘要】：目的:分离并培养人脐带间充质干细胞,鉴定细胞表型,在体外用单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞并探索其最佳诱导浓度。方法:获取新生儿脐带,剔除脐动、静脉,将间质组织剪成微小组织块,用胶原酶消化后将脐带组织置于含有胎牛血清、营养因子、青链霉素混合液的高糖DMEM培养基中培养,原代细胞12小时后全量换液,24小时后半量换液,之后每3天换液一次,每次换液时用倒置显微镜观察细胞生长状况,贴壁情况,计数细胞生长密度,并拍照记录。当观察到培养瓶中的细胞呈放射状生长,或排列成漩涡状时,加入胎牛血清终止消化,用胰蛋白酶消化后,按照1:2或1:3的比例传代,记为P1。依次类推,记为P2,P3。绘制细胞生长曲线。取培养处于对数生长期的P3,P5,P10代细胞作细胞,用胰酶消化,用PBS缓冲液漂洗后重悬为单细胞悬浮液,细胞计数板计数细胞密度,以大于105个的量平均分装于10个EP管中,滴加单克隆抗体CD73、CD90和CD105、CD19、CD34、CD45、CD11b和组织相容性抗原HLA-DR(MHC-II),用抗鼠Ig G1-PE和Ig G1-FITC单克隆抗体作为同型对照。扩增后,取第3代细胞,分为A、B、C、D、E 5组,前4组为实验组,E组为对照组,实验组各组GM1浓度分别为:A组50μg/m L、B组100μg/m L、C组150μg/m L、D组200μg/m L,诱导液用L-DMEM培养基配制,对照组只含L-DMEM培养基。观察5组诱导液诱导h UMSCs的神经分化的作用,每间隔1h观察诱导后细胞的形态变化,于第6h用免疫细胞化学染色方法检测神经元特异性标记物微管结合蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(NF-H)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况,并计算阳性细胞比率,结果以X±s表示。结果:可以从脐带中分离并培养间充质干细胞,原代培养的细胞在12h内大部分细胞能贴壁,细胞呈菱形、多边形,之后逐渐变为长梭形细胞快速生长,并能稳定的传代,至第10代仍能保持旺盛的增殖能力。当细胞培养至第7天时细胞呈放射状、旋涡状生长,并可见细胞因生长密度过大造成脱落。用流式细胞技术进行的细胞表型鉴定显示P3、P5和P10代细胞均表达间充质干细胞表面标记物CD73、CD90和CD105,而不表达造血干细胞标记物CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR,证明所培养的细胞为间充质干细胞。诱导后1h,实验组各组均可见部分细胞胞体收缩为椭圆状,两端伸出突起,呈纺锤样,以D组神经样细胞数量最多,A组最少;第2、3h各组神经样细胞数量逐渐增加,突起伸长,以D组比率最高;第4h时,A、B、C组神经样细胞数继续增加,表现为双极或多极细胞,以双极细胞为主,D组神经样细胞开始脱落,比率不再增加;第5h时,A、B组神经样细胞增加不明显,可见部分细胞脱落,C组神经样细胞数目最多,也伴随少量细胞脱落,D组神经样细胞呈片状脱落,比率明显下降;第6h时,A、B组神经样细胞不再增加,C组神经样细胞未见明显变化,D组视野内仅见少量未脱落的神经样细胞;E组诱导前后细胞形态未见明显变化。诱导至第6小时,免疫细胞化学染色显示实验组各组神经样细胞成熟神经细胞标记物微管结合蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(NF-H)呈阳性表达,而胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阴性,150μg/m L组细胞的MAP-2、NF-H阳性表达率最高。对照组诱导前后无明显变化。结论:人脐带间充质干细胞可以从脐带组织中分离出来并可以稳定的传代,并表达间充质干细胞表面标志,单唾液酸四己糖神经节苷脂可以诱导h UMSCs向神经样细胞分化,并表达成熟神经细胞标志物微管结合蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(NF-H),150μg/m L为最合适诱导剂量。
【关键词】：单唾液酸四己糖神经节苷脂 人脐带间充质干细胞 诱导分化 神经样细胞
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-8
• 前言8
• 材料与方法8-13
• 结果13-15
• 附图15-23
• 附表23-24
• 讨论24-26
• 结论26-27
• 参考文献27-29
• 综述 间充质干细胞向神经细胞分化并治疗中枢神经系统疾病的研究进展29-38
• 参考文献35-38
• 致谢38-39
• 个人简历39

【参考文献】

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本文编号：685872