新烷化剂替莫唑胺酯抗脑胶质瘤的作用及机制研究

发布时间：2017-08-19 17:31

  本文关键词：新烷化剂替莫唑胺酯抗脑胶质瘤的作用及机制研究

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【摘要】：目的:1.考察新烷化剂替莫唑胺酯(TMZ-HE)体外对恶性脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用。2.进一步考察TMZ-HE对TMZ耐药细胞系的抑制作用3.初步探讨TMZ-HE抑制脑胶质瘤细胞增殖和克服TMZ耐药的作用机制。方法:1.为检测TMZ-HE体外对恶性脑胶质瘤细胞的作用效果,选取三种MGMT表达水平不同的胶质瘤细胞系,采用MTT比色法检测TMZ-HE对胶质瘤细胞T98G,LN229和LN-18的增殖抑制作用;利用克隆形成能力实验检测TMZ-HE对胶质瘤细胞LN-18克隆形成的影响;利用流式细胞仪检测TMZ-HE诱导胶质瘤细胞凋亡的发生率;2.为进一步验证TMZ-HE克服脑胶质瘤细胞系对TMZ耐药的作用,首先通过慢病毒感染法构建高表达MGMT的LN229/MGMT耐药细胞系,再通过药物分期诱导建立不表达MGMT的耐药细胞系SHG-44/TMZ;采用Western Blot法鉴定LN229/MGMT和SHG-44/TMZ两种耐药细胞系中MGMT的表达情况后,利用MTT比色法检测TMZ-HE对耐药细胞系LN229/MGMT和SHG-44/TMZ的增殖抑制作用;3.为初步探讨TMZ-HE的作用机制,检测TMZ-HE对耐药蛋白MGMT的影响以及诱导细胞凋亡的作用机制;通过Western Blot检测药物处理后T98G细胞中耐药蛋白MGMT表达、LN229,T98G细胞中DNA损伤指标γH2AX蛋白表达以及促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达;通过流式细胞仪检测TMZ-HE对胶质瘤细胞周期的影响;结果:1.TMZ-HE对MGMT表达水平不同的胶质瘤细胞系都具有增殖抑制和诱导凋亡的作用,且体外作用效果优于TMZ。1)Western blot实验结果显示,T98G细胞中耐药蛋白MGMT表达量最高,其次为LN-18细胞,敏感细胞系LN229中不表达耐药蛋白MGMT。2)MTT实验结果显示,TMZ-HE能够抑制胶质瘤细胞系LN229,LN-18和T98G的增殖,且抑制作用优于TMZ,说明,TMZ-HE对MGMT不同表达水平的胶质瘤细胞的增殖抑制作用均优于TMZ。3)流式细胞仪检测结果表明TMZ,TMZ-HE能够诱导胶质瘤细胞发生凋亡,药物作用96h其凋亡率随药物浓度增加不断增加,200,400μmol/L的TMZ-HE诱导LN229,T98G细胞的凋亡率明显高于TMZ,结果具有显著的统计学差异。2.TMZ-HE一定程度上能够克服TMZ耐药,特别是MGMT高表达的耐药细胞。1)胶质瘤耐药细胞的建立:Western blot结果显示LN229/MGMT细胞中高表达MGMT,SHG-44/TMZ细胞中不表达MGMT。2)TMZ-HE和TMZ对原发及获得性耐药细胞增殖抑制作用的比较:MTT实验结果表明,①TMZ-HE对高表达MGMT的原发耐药细胞系T98G和获得性耐药细胞系LN229/MGMT的增殖抑制作用优于TMZ,对MGMT不表达的耐药细胞系SHG-44/TMZ的增殖抑制作用同样优于TMZ(P0.05);②TMZ-HE和TMZ对不表达MGMT的耐药细胞系SHG-44/TMZ增殖抑制作用不如表达MGMT的耐药细胞系。TMZ-HE对耐药细胞系的增殖抑制作用由大到小为LN229/MGMTT98GSHG-44/TMZ。3.针对实验中测试的几个可能作用机制,TMZ-HE与TMZ对其关键蛋白的调节趋势相似,但TMZ-HE的调节作用明显高于TMZ。1)增加DNA损伤指标γH2AX的表达量:TMZ、TMZ-HE作用LN229、T98G细胞后,均能导致DNA损伤指标γH2AX的表达量增加。2)调节细胞凋亡:TMZ和TMZ-HE均通过上调促凋亡蛋白Bax,下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达诱导细胞发生凋亡。3)细胞周期阻滞:TMZ和TMZ-HE能够使胶质瘤细胞发生G2期阻滞,但400μmol/L的TMZ-HE还能导致细胞的S期发生阻滞。4)下调耐药蛋白对MGMT表达量:Western blot法检测TMZ、TMZ-HE处理T98G后MGMT蛋白的表达量,其结果表明,两种药物均能下调MGMT的表达量,但与TMZ相比,TMZ-HE对MGMT表达量的下调作用表现得更强也更快速。结论:1.TMZ-HE能够抑制敏感和原发性耐药胶质瘤细胞增殖,同时能够诱导其发生凋亡,其增殖抑制和诱导凋亡的作用效果都优于TMZ。2.TMZ-HE对耐药蛋白MGMT的抑制活性明显的高于TMZ。,在一定程度上克服了胶质瘤细胞对TMZ的原发和获得性耐药。3.TMZ-HE抑制胶质瘤细胞增殖的作用机制与TMZ相似,既可通过造成DNA损伤,又可通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2及上调促凋亡基因Bax诱导细胞凋亡。此外,两者还具有G2期阻滞作用;但是TMZ-HE对耐药蛋白MGMT的抑制活性明显高于TMZ,这可能与TMZ-HE的作用效果优于TMZ有关。
【关键词】：替莫唑胺 替莫唑胺酯 细胞凋亡 Bax
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 缩略语/符号说明12-13
• 前言13-19
• 研究现状、成果13-17
• 研究目的、方法17-19
• 一、TMZ-HE对恶性脑胶质瘤体外的抑制作用19-43
• 1.1 对象和材料19-20
• 1.1.1 实验对象19
• 1.1.2 实验材料19
• 1.1.3 实验仪器19
• 1.1.4 主要试剂配制19-20
• 1.1.5 统计学方法20
• 1.2 方法20-26
• 1.3 结果26-40
• 1.3.1 LN229, T98G, LN18细胞中耐药蛋白MGMT的表达量26
• 1.3.2 TMZ-HE对LN229,T98G及LN-18细胞增殖抑制的作用26-29
• 1.3.3 TMZ-HE对LN229,T98G及LN-18细胞克隆形成的影响29-32
• 1.3.4 流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡率和死亡率32-40
• 1.4 讨论40-42
• 1.5 小结42-43
• 二、TMZ-HE对获得性耐药胶质瘤细胞系的增殖抑制作用43-51
• 2.1 对象和材料43-44
• 2.1.1 实验对象43
• 2.1.2 实验材料43
• 2.1.3 实验仪器43
• 2.1.4 主要试剂配制43-44
• 2.1.5 统计学方法44
• 2.2 方法44-47
• 2.3 结果47-49
• 2.3.1 获得性耐药细胞系LN229/MGMT的建立47
• 2.3.2 获得性耐药细胞系SHG-44/TMZ的建立47-48
• 2.3.3 TMZ-HE对耐药细胞系T98G, LN229-MGMT, SHG-44/TMZ细胞的增殖抑制作用48-49
• 2.4 讨论49-50
• 2.5 小结50-51
• 三、TMZ-HE对恶性脑胶质瘤细胞抑制作用的机制51-61
• 3.1 对象和材料51-52
• 3.1.1 实验对象51
• 3.1.2 实验材料51
• 3.1.3 实验仪器51-52
• 3.1.4 主要试剂配制52
• 3.1.5 统计学方法52
• 3.2 方法52-54
• 3.3 结果54-58
• 3.3.1 TMZ-HE导致LN229, T98G细胞中DNA损伤指标 γH2AX蛋白表达升高54-55
• 3.3.2 TMZ-HE能够导致胶质瘤LN229, T98G细胞内Bcl-2 蛋白表达降低、Bax蛋白表达增加55-56
• 3.3.3 TMZ-HE能够使胶质瘤细胞发生S和G2期阻滞56-57
• 3.3.4 TMZ-HE能够使T98G细胞中耐药蛋白MGMT表达含量降低57-58
• 3.4 讨论58-60
• 3.5 小结60-61
• 结论61-62
• 参考文献62-67
• 发表论文和参加科研情况说明67-68
• 综述 有关替莫唑胺耐药因素的研究进展68-77
• 综述参考文献74-77
• 致谢77

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