厚朴酚对戊四氮点燃慢性癫痫大鼠行为及海马BDNF表达的影响

发布时间：2017-08-28 11:09

  本文关键词：厚朴酚对戊四氮点燃慢性癫痫大鼠行为及海马BDNF表达的影响

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【摘要】：目的:癫痫是神经系统中一种常见的慢性疾病,影响着约全世界大约有1%-2%人口,具有较高的发生率和死亡率。其临床特征为短暂性、发作性、重复性、刻板性。电生理特征为脑内神经元高度同步化异常放电。以神经元凋亡,尤其是海马等边缘系统的神经元凋亡伴胶质细胞增生为主要病理改变。目前,有效药物治疗仅能控制住70%的癫痫发作,仍有30%癫痫患者发展成难治性癫痫,约30-40%的患者伴有认知功能障碍,表现为记忆力减退、语言障碍、执行力差、社会认知障碍等方面。因此,癫痫仍然是困扰人类的一大难题,寻求一种既能控制癫痫发作又能改善认知功能的药物迫在眉睫。本实验的研究对象为戊四氮点燃的慢性癫痫大鼠模型,分别用厚朴酚(magnolol,Mag)高、中、低三个剂量对其进行干预,统计点燃率来反应癫痫发作情况,通过Morris水迷宫检测致痫大鼠认知功能,应用Western Blot及免疫组化方法检测BDNF(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)在海马组织中的表达情况,以观察厚朴酚对戊四氮点燃癫痫大鼠的行为、认知及海马BDNF表达的影响,并初步探讨厚朴酚对戊四氮(Pentylenetetrazole,PTZ)致痫大鼠的神经保护机制。方法:选用健康清洁的雄性SD大鼠75只,体重约为250-300g。采用随机对照分组原则,分为正常对照组(NC组)、戊四氮组(PTZ组)、低剂量厚朴酚组(L组)、中剂量厚朴酚组(M组)、和高剂量厚朴酚组(H组),每组大鼠15只。自实验第一天起,每天上午10点除NC组外各组大鼠腹腔注射PTZ 35mg/kg,NC组大鼠注射相同计量的生理盐水,共计42天。L组、M组和H组于注射PTZ前半小时分别通过腹腔注射低剂量(2.5mg/kg)厚朴酚、中剂量(5mg/kg)厚朴酚、高剂量(10mg/kg)厚朴酚。打药后分别观察大鼠癫痫发作情况1小时,依据Racine分级来评价大鼠癫痫发作等级。于药物注射结束24小时后,进行Morris水迷宫测试评价学习记忆能力,从而评估认知受损情况。水迷宫实验结束后断头取脑分离海马组织,用Western Blot方法检测BDNF蛋白表达水平;对相关脑组织固定,用透射电镜观察海马CA1区超微结构变化或者免疫组织化学方法观察BDNF在海马中的表达情况。结果:1行为学观察PTZ组大鼠从第4-6天开始反复出现洗脸、点头及面部抽搐等表现,第7-15天出现单侧前肢或双前肢抬起、全身肌阵挛,最终出现全身强直阵挛性发作,达到Racine分级完全点燃的标准。截止到第42天,点燃大鼠毛发无光泽,精神萎靡,饮食尚可,体重未出现明显变化。PTZ组大鼠点燃率为93.3%,明显高于L组、M组、H组和NC组(P0.05)。与PTZ组大鼠相比,厚朴酚给药组大鼠点燃时间延长,发作等级明显降低,第8-10天大鼠开始出现洗脸、点头及面部抽搐等表现。截止到第42天,厚朴酚给药组大鼠中L组、M组、H组大鼠点燃率分别为6.7%、13.3%、33.3%,三组间两两比较具有统计学意义(P0.05)。2水迷宫测试结果定位航行实验结果:①以各组大鼠每日逃避潜伏期均值进行比较。⑴实验第1天,PTZ组大鼠的逃避潜伏期(71.635±6.905)与NC组大鼠(42.206±8.316)相比有所延长,与PTZ组相比,H组(60.158±6.302)、M组(57.426±5.912)和L组(59.346±7.213)的逃避潜伏期均有所缩短,但各组间比较无统计学意义(P0.05)。⑵第2天,各组大鼠逃避潜伏期均比第1天明显缩短(P0.05),PTZ组的逃避潜伏期(28.563±4.372)与NC组(8.452±2.121)相比明显延长(P0.05);与PTZ组相比,H组(21.260±5.165)、M组(17.123±5.272)和L组(20.145±4.265)的逃避潜伏期均有所缩短(P0.05),且与NC组比较有统计学意义(P0.05)。⑶第3天,各组大鼠逃避潜伏期均较第2天明显缩短(P0.05),NC组(6.258±2.192)、PTZ组(23.456±4.265)、H组(15.321±4.132)、M组(12.365±3.234)、L组(14.259±3.124)的逃避潜伏期相互比较结果同第2天。⑷各组大鼠逃避潜伏期均较第3天又明显缩短(P0.05),NC组(4.625±1.151)、PTZ组(16.235±2.532)、H组(8.632±2.171)、M组(7.235±1.185)、L组(9.125±1.905)的逃避潜伏期相互比较结果与第3天相同。提示PTZ致痫大鼠学习记忆能力下降,厚朴酚可以部分改善其学习记忆能力。②空间探索试验结果:PTZ组大鼠(2.78±1.05)与NC组大鼠(19.73±3.21)相比,穿越平台次数明显减少(P0.05);与PTZ组相比,H组(8.63±2.73)、M组(12.71±2.74)、L组(10.89±3.41)穿越平台次数明显增多(P0.05),与NC组相比亦有统计学意义(P0.05)。提示慢性癫痫大鼠的空间记忆能力下降,而厚朴酚可以改善其空间记忆能力。3透射电镜观察海马CA1区超微结构变化NC组电镜观察:神经元形态结构完整,细胞核呈圆形,染色质分布均匀,细胞器丰富,可见圆形或椭圆型线粒体,线粒体嵴清晰,粗面内质网及高尔基体发达,突触前后膜结构清晰,靠近突触前膜可见许多突触囊泡,突触间隙清晰。PTZ组电镜观察:海马神经元内质网扩张明显,线粒体肿胀,嵴变少,细胞核染色质固缩,突触数量减少,突触前后膜模糊不清,突触间隙增宽,突触囊泡数量减少。L组及M组海马神经元细胞核结构完整,无固缩现象,细胞器的形态基本正常,突触数量基本不减少,突触前后膜较清楚,突触前膜的囊泡数量较多。H组海马神经元可见线粒体肿胀,嵴变少,内质网扩张,突触囊泡数量较少,间隙增宽。4 BDNF免疫组化结果NC组、PTZ组、L组、M组及H组大鼠海马组织中均可见到弥漫分布的BDNF免疫反应产物,阳性细胞主要表达在细胞浆中,为染色较深的棕褐色颗粒。NC组海马CA1及CA3区400倍视野阳性细胞数分别为(85.672±6.566,87.369±6.354);PTZ组海马CA1区及CA3区400倍视野阳性细胞数分别为(37.743±7.393,35.521±5.231);H组海马CA1区及CA3区400倍视野阳性细胞数分别为(34.245±5.051,34.965±5.967);M组海马CA1区及CA3区400倍视野阳性细胞数分别为(69.662±6.093,68.348±6.147);L组海马CA1区及CA3区400倍视野阳性细胞数分别为(55.863±8.125,57.625±7.159)。与L、M组及N组相比,PTZ组海马CA1及CA3区400倍视野阳性细胞数明显降低(P0.05);与H组相比,PTZ组海马CA1及CA3区400倍视野阳性细胞数升高,但是无统计学意义(P0.05);与N组相比,L组、M组、H组海马CA1及CA3区400倍视野阳性细胞数显著下降(P0.05),N组与L组、M组、H组之间两两比较亦有统计学意义(P0.05)。5 BDNF Western blot结果与L组(1.148±0.112)、M组(1.972±0.158)及N组(2.317±0.163)相比,PTZ组海马BDNF蛋白表达水平(1.215±0.167)明显降低(P0.05);与H组(1.148±0.112)相比,PTZ组海马BDNF蛋白表达水平升高,但是无统计学意义(P0.05)。与N组相比,L组、M组、H组海马BDNF蛋白表达水平显著下降(P0.05),N组与L组、M组、H组之间比较海马BDNF蛋白表达水平有统计学意义(P0.05)。结论:1本实验采用戊四氮化学点燃方法成功建立了伴有认知功能损害的慢性癫痫大鼠模型。2癫痫发作可以导致透射电镜下大鼠海马组织超微结构的改变。3癫痫发作可导致大鼠海马组织中BDNF蛋白表达下降。4厚朴酚能够降低大鼠癫痫发作率并且改善致痫大鼠认知功能。进而推测其可能机制为通过上调大鼠海马组织中BDNF水平从而起到神经保护作用。5本实验中,5mg/kg厚朴酚剂量可能为改善认知功能且降低癫痫发作可能性的最佳剂量。
【关键词】：癫痫 厚朴酚 戊四氮 认知功能 BDNF
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.1
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文缩写13-14
• 前言14-15
• 材料与方法15-23
• 结果23-26
• 附图26-34
• 附表34-37
• 讨论37-39
• 结论39-40
• 参考文献40-42
• 综述 浅谈颞叶内侧癫痫对认知功能的影响42-49
• 参考文献47-49
• 致谢49-50
• 个人简历50

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本文编号：747750