N2a细胞氧糖剥夺模型中Ⅲ型PI3K-Beclin 1自噬途径的研究

发布时间：2017-08-29 08:13

  本文关键词：N2a细胞氧糖剥夺模型中Ⅲ型PI3K-Beclin 1自噬途径的研究

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【摘要】：我国作为人口大国,早已步入了老龄化社会。年龄作为脑血管疾病的不可干预危险因素,卒中患病率随年龄逐渐上升,60岁~64岁达到患病高峰,随后逐渐下降。2014年中国脑卒中大会的数据表明,近25年,我国脑卒中患病率以每年8.1%速度增加。脑梗死在我国卒中患者数量中位居首位,约占78%。缺血性脑卒中的发生发展机制复杂,尚未完全明确。因此,近年来,探索缺血性脑卒中的发生发展机制已成为神经科学领域研究的重点和难点。自噬是一种由溶酶体介导的细胞内代谢机制。该机制负责降解和循环再利用受损及功能丧失的细胞成分和细胞器。自噬过程主要包括自噬体的形成以及自噬溶酶体的形成(后者是自噬体与溶酶体的融合)。近年来,越来越多的研究表明自噬参与脑血管疾病之中。但至于自噬在脑血管疾病发生发展中的作用,目前并没有统一的定论。脑缺血可以通过多种信号通路来激活自噬,本实验主要探讨Ⅲ型PI3K-Beclin 1自噬途径在缺血性脑血管疾病中的作用。本实验首先采用小鼠神经瘤母细胞(mouse neuroblastoma N2a cells,N2a)经过氧糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)处理来模拟脑缺血损伤。自噬相关蛋白包括微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、Beclin 1、P62又称为死骨片1(Sequestosome 1,SQSTM1)和溶酶体相关膜蛋白2(lysosome-associated membrane protein 2,LAMP2)等。应用western blot方法检测这些自噬相关蛋白的表达量,并测定经过OGD处理后N2a细胞酸性磷酸酶活性及细胞活力。然后我们检测了PI3K抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)对经过OGD处理的N2a细胞自噬相关蛋白表达水平,细胞活力及酸性磷酸酶活性的影响。最后我们应用shRNA慢病毒技术干扰Beclin 1基因表达后再分析经过OGD处理的N2a细胞自噬相关蛋白表达、酸性磷酸酶活性以及细胞活力的影响。结果显示:1)在OGD处理后,N2a细胞LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1及p62/SQSTM1蛋白均表达增加,而LAMP2蛋白变化不明显;OGD处理增加了酸性磷酸酶活性而减弱了细胞活力。2)N2a细胞给予3-MA(5mM)后,减少了经过OGD处理后LC3Ⅱ以及LC3Ⅱ/Ⅰ的表达,增加了p62/SQSTM1的表达,而对LAMP2和Beclin 1的蛋白表达影响不明显;不管是对照组还是OGD组,使用3-MA后,N2a细胞酸性磷酸酶活性和细胞活力都明显下降。3)无论在对照组,还是在OGD8 h和OGD12 h组,当Beclin 1的表达被干扰后,N2a细胞LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62/SQSTM1和LAMP2蛋白表达均增加、酸性磷酸酶活性增加,而细胞活力变化不明显。综上所述,本研究通过以上一系列的实验初步证实了:1)OGD处理能诱导Beclin 1非依赖性自噬,且此种自噬是不通过Ⅲ型PI3K-Beclin 1信号途径而进行调控的;2)OGD处理增加的自噬活性对细胞是起保护性作用的;3)p62/SQSTM1的蛋白表达水平与细胞自噬活性并不总是呈负相关。
【关键词】：自噬 脑缺血 氧糖剥夺 Ⅲ型PI3K Beclin 1非依赖性自噬
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 缩略词表12-14
• 绪论14-20
• 第一部分 N2a细胞氧糖模型的建立20-36
• 引言20
• 1.1 实验材料20-22
• 1.1.1 细胞株20
• 1.1.2 主要试剂20-22
• 1.1.3 主要仪器设备22
• 1.2 实验方法22-30
• 1.2.1 N2a细胞培养22-23
• 1.2.2 OGD细胞模型的建立23-24
• 1.2.3 CCK8检测OGD后各组细胞活力24
• 1.2.4 Western blot检测OGD后自噬相关蛋白的表达24-28
• 1.2.5 酸性磷酸酶活性的检测28-29
• 1.2.6 统计学处理29-30
• 1.3 实验结果30-34
• 1.3.1 OGD后N2a的细胞形态变化30
• 1.3.2 OGD处理减弱N2a细胞活力30-31
• 1.3.3 OGD增加N2a细胞自噬相关蛋白表达31-33
• 1.3.4 OGD增加了N2a细胞酸性磷酸酶活性33-34
• 1.4 实验结论34-36
• 第二部分 OGD中3-MA对N2a细胞自噬及活性的影响36-46
• 引言36
• 2.1 实验材料36-38
• 2.1.1 细胞株36
• 2.1.2 主要试剂36-38
• 2.1.3 主要仪器设备38
• 2.2 实验方法38-41
• 2.2.1 N2a细胞培养38-39
• 2.2.2 3-MA储存于的配制及用法39
• 2.2.3 Western blot检测 3-MA处理后N2a细胞的自噬相关蛋白表达39-40
• 2.2.4 酸性磷酸酶活性的检测40
• 2.2.5 CCK8检测OGD后各组细胞活力40-41
• 2.2.6 统计学处理41
• 2.3 实验结果41-44
• 2.3.1 3-MA对自噬相关蛋白表达的影响41-42
• 2.3.2 3-MA降低N2a细胞酸性磷酸酶活性42-43
• 2.3.3 3-MA降低N2a细胞活力43-44
• 2.4 实验结论44-46
• 第三部分 Beclin 1基因沉默对OGD中N2a细胞自噬及活性的影响46-73
• 引言46-47
• 3.1 实验材料47-49
• 3.1.1 质粒、菌种和细胞株47
• 3.1.2 主要试剂47-49
• 3.1.3 主要仪器设备49
• 3.2 实验方法49-62
• 3.2.1 sh RNA序列设计49-51
• 3.2.2 构建表达sh RNA的质粒载体51-55
• 3.2.3 293FT细胞培养55-56
• 3.2.4 重组质粒转染 293FT细胞56
• 3.2.5 慢病毒感染N2a细胞56-57
• 3.2.6 q RT-PCR检测Beclin 1 m RNA表达水平57-60
• 3.2.7 western检测蛋白的表达水平60
• 3.2.8 Beclin 1 干扰后对N2a细胞酸性磷酸酶活性的作用60-61
• 3.2.9 Beclin 1 干扰后对N2a细胞活力的影响61-62
• 3.2.10 统计学处理62
• 3.3 实验结果62-69
• 3.3.1 sh RNA质粒构建成功62-63
• 3.3.2 慢病毒成功感染N2a细胞63-64
• 3.3.3 Beclin 1 sh RNA抑制N2a细胞中Beclin 1 m RNA表达64-65
• 3.3.4 Beclin 1 sh RNA抑制N2a细胞中Beclin 1 蛋白表达65-66
• 3.3.5 Beclin 1 干扰后对自噬相关蛋白表达的影响66-67
• 3.3.6 Beclin 1 干扰后增加了N2a细胞酸性磷酸酶活性67-68
• 3.3.7 Beclin 1 干扰后对N2a细胞自噬活性的影响68-69
• 3.4 实验结论69-73
• 全文结论73-74
• 参考文献74-78
• 致谢78-79
• 攻读学位期间发表的学术论文目录79

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本文编号：752230