褪黑素对实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠的神经保护作用及其抗氧化应激机制

发布时间：2017-09-01 15:35

  本文关键词：褪黑素对实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠的神经保护作用及其抗氧化应激机制

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【摘要】：目的:探讨褪黑素(MT)对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)小鼠发病的神经保护作用及其抗氧化应激机制,为多发性硬化(MS)寻找新的治疗药物。方法:将48只雌性C57BL/6小鼠(周龄6-8周,体重18-22g)随机分成正常对照组、EAE对照组、MT干预组,每组16只;各组再随机分为甲、乙两个亚组。利用MOG35-55多肽、完全弗氏佐剂(CFA)、结核杆菌H37Ra、百日咳毒素(PTX)等对EAE对照组和MT干预组小鼠进行免疫制备EAE动物模型。正常对照组仅注射不含MOG35-55的CFA。以Benson 5分评分标准每天对小鼠进行1次神经功能障碍评分,并记录各组小鼠活动、进食、毛发、体重等情况。自造模当天开始MT干预组给予腹腔注射MT10 mg/kg(10mg/ml),而正常对照组与EAE对照组每日腹腔注射生理盐水1ml/kg。EAE对照组和MT干预组按照上述要求连续注射药物至发病高峰期,处死小鼠取材。若小鼠连续3天评分无加重、四肢完全瘫痪、濒临死亡或者死亡作为EAE发病高峰期。正常对照组及其余未发病小鼠则于造模后28天处死、取材。所有甲亚组小鼠经4%甲醛灌注固定后取脊髓,乙亚组则在冰盘上断头迅速取出脑组织,制作成脑组织匀浆,离心后取上清液放置于-80℃冰箱保存备用。待所有小鼠全部取材完毕后,甲亚组用免疫组化法观察脊髓转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶-1(HO-1)的表达情况,以及用HE染色观察脊髓实质中炎性细胞浸润及特殊的“血管袖套”现象;乙亚组则分别用黄嘌呤氧化酶法和紫外分光法检测脑组织匀浆中超氧化物歧化酶(sod)及过氧化氢酶(cat)活力;用比色法和化学荧光法检测组织匀浆中硫代巴比妥酸反应产物(tbars)和活性氧(ros)含量。结果:(1)实验小鼠发病情况观察:正常对照组中无发病小鼠。eae对照组、mt干预组均有不同程度发病,其发病率分别为81.2%、56.3%(p0.05)。(2)实验小鼠神经功能障碍评分、潜伏期及进展期变化:eae对照组和mt干预组发病高峰期神经功能障碍评分分别为2.8±1.0分、1.4±0.7分。mt干预组小鼠神经功能障碍程度较eae对照组明显减轻(p0.05)。mt干预组的发病潜伏期为15.23±1.86天,较eae对照组的发病潜伏期(12.77±1.92天)明显延长(p0.05)。mt干预组的发病进展期为4.00±0.87天,较eae对照组的进展期(6.92±1.80天)明显缩短(p0.05)。(3)组织病理改变:正常对照组小鼠脊髓组织无异常。eae对照组小鼠发病高峰期可见脊髓实质内大量炎性细胞浸润,典型者可在小静脉周围形成“袖套”状改变,在脊髓的腰膨大前正中裂周围这种改变较为明显。而mt干预组炎性细胞浸润情况较eae对照组有所减轻,“血管袖套”现象也较少见。(4)各组小鼠脑组织匀浆sod和cat活力:发病高峰期,正常对照组、eae对照组、mt干预组sod活力分别是164.72±6.68、107.09±26.41、132.13±17.72u/mgprot。正常对照组、eae对照组、mt干预组cat活力分为10.69±0.70、5.69±1.67、7.50±2.24umol/mgprot。eae对照组、mt干预组sod及cat活力较正常对照组均明显降低(p0.05);mt干预组sod及cat活力较eae对照组均明显升高(p0.05)。(5)各组小鼠脑组织匀浆tbars和ros含量:发病高峰期,正常对照组、eae对照组、mt干预组tbars含量分别是19.50±3.47、38.77±12.32、28.86±7.52ug/g,正常对照组、eae对照组、mt干预组ros含量分别为47.00±4.53、92.63±25.03、69.00±17.25ηnmol/mgprot。eae对照组、mt干预组tbars和ros含量均显著高于正常对照组(p0.05),mt干预组tbars和ros含量较eae对照组明显下降(p0.05)。(6)实验小鼠脊髓nrf2和ho-1表达:发病高峰期,正常对照组、eae对照组、mt干预组脊髓nrf2表达阳性细胞计数分别是15.13±3.27、27.63±3.58、54.88±10.01个,正常对照组、eae对照组、mt干预组脊髓ho-1阳性细胞计数分别为11.50±2.82、30.38±9.72、48.88±13.97个。eae对照组和mt干预组nrf2及ho-1的表达均较正常对照组小鼠明显升高(p0.05),mt干预组nrf2和ho-1表达较eae对照组升高更明显(p0.05)。(7)相关性分析:eae对照组和mt干预组小鼠发病高峰期神经功能障碍评分与脑组织匀浆sod和cat活力及脊髓组织nrf2和ho-1表达呈负相关(p0.05);与脑组织匀浆tbars和ros含量呈正相关(p0.05)。eae对照组和mt干预组小鼠潜伏期与脑组织匀浆sod和cat活力及脊髓组织nrf2和ho-1表达呈负相关(p0.05);与脑组织匀浆tbars和ros含量呈正相关(p0.05)。eae对照组和mt干预组小鼠进展期与脑组织匀浆sod和cat活力及脊髓组织nrf2和ho-1表达呈负相关(p0.05);与脑组织匀浆tbars和ros含量呈正相关(p0.05)。结论:(1)本实验采用皮下注射mog35-55多肽建立eae模型,发病小鼠神经功能障碍明显,脊髓实质中有大量的炎性细胞浸润,在血管周围细胞聚集可呈“袖套状”改变,说明此法造模成功,可重复性好。(2)EAE发病中存在着氧化和抗氧化失衡,TBARS、ROS含量增加,抗氧化酶SOD、CAT活力降低,氧化应激损害可能是导致EAE不断进展的一个重要因素。(3)MT可以降低EAE小鼠发病高峰期神经功能障碍评分、延长潜伏期、缩短进展期,减少脊髓组织中炎性细胞浸润,提示MT对EAE小鼠具有神经保护作用。(4)MT对EAE小鼠的保护作用可能是通过激活Nrf2/ARE信号通路,抑制脂质过氧化、上调抗氧化酶活性,降低氧化应激损害而发挥的。
【关键词】：褪黑素 实验变态反应性脑脊髓炎 氧化应激
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R744.5
【目录】：

• 中文摘要3-7
• 英文摘要7-13
• 前言13-17
• 材料与方法17-25
• 结果25-33
• 讨论33-46
• 结论46-47
• 参考文献47-54
• 英汉缩略词对照表54-56
• 致谢56-57
• 多发性硬化的疾病修正治疗研究进展（综述）57-68
• 参考文献63-68

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