肿瘤坏死因子通过自噬溶酶体途径影响α-突触核蛋白的清除

发布时间：2017-09-01 21:28

  本文关键词：肿瘤坏死因子通过自噬溶酶体途径影响α-突触核蛋白的清除

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【摘要】：目的:研究肿瘤坏死因子(TNF)对α-突触核蛋白(α-synuclein)降解清除的影响,探讨自噬溶酶体通路在其中的作用和机制。方法:以高分化PC12细胞为工具细胞,以重组TNF或活化的小胶质细胞释放的TNF作用于PC12细胞作为模型。以细菌脂多糖(LPS)作用于BV2小胶质细胞并收集培养上清作为小胶质细胞条件性培养基,以ELISA检测条件培养基内TNF及IL-1β的含量;使用CCK8法检测细胞存活率;采用Western blot方法检测α-synuclein蛋白、自噬标记蛋白LC3II、p62及溶酶体表面标志物LAMP1等蛋白的表达变化;利用瞬时转染方法的方法构建PC12细胞内LC3过表达模型;运用反转录PCR方法检测α-synuclein和p62的m RNA水平;联合免疫荧光和共聚焦荧光显微镜观察细胞内自噬相关蛋白LC3和溶酶体标记物LAMP1共定位;以Lyso Tracker检测溶酶体酸性强度;使用Lyso Sensor Yellow/Blue dextran探针定量测定溶酶体内的p H。结果:LPS作用后的小胶质细胞条件性培养基中IL-1β含量约为(320±67.8)pg/ml,TNF含量约为(1400±93.2)pg/ml,均显著高于对照组(P0.01)。以anti-TNF抗体与条件性培养基共孵育后,条件培养上清中TNF含量明显减少,而IL-1β含量无显著变化。将anti-TNF抗体结合或未结合的LPS刺激的条件性培养基或阴性对照组条件性培养基转移作用于PC12细胞,LPS刺激的条件性培养基组(anti-TNF未结合)α-synuclein水平明显高于正常PC12对照组和阴性对照条件培养基作用组,TNF去除组(与anti-TNF抗体结合)α-synuclein蛋白水平明显低于anti-TNF未结合组,。重组小鼠源性TNF-α(0、1、5、10、50、100和500 ng/ml)作用于PC12细胞,细胞存活率呈TNF-α浓度依赖性下降,α-synuclein的蛋白水平呈TNF-α浓度依赖性先上升后下降,而α-synuclein的m RNA水平无显著变化;用蛋白酶体抑制剂MG132抑制UPS通路时,α-synuclein的蛋白水平对比对照组并未发生明显的改变,用自噬阻断剂CQ抑制ALP通路时,α-synuclein的蛋白水平较对照组明显增加;LC3-Ⅱ和p62的蛋白水平出现TNF-α浓度依赖性的同步增加,而p62的m RNA并未出现改变,过表达LC3后游离GFP蛋白水平随TNF-α的作用下降;在TNF-α的作用下,PC12细胞内的GFP-LC3(绿色荧光)和溶酶体标志物LAMP1(红色荧光)可以完全共定位,Lyso Tracker荧光强度下降,溶酶体内p H上升;m TORC1抑制剂PP242可以促进溶酶体酸化,转录因子EB(TFEB)和溶酶体表面标志蛋白(LAMP1)表达水平上调,溶酶体p H降低,部分逆转TNF引起的α-synuclein蛋白的蓄积增加。结论:TNF是激活的小胶质细胞生成和分泌的主要促炎症细胞因子之一;TNF导致PC12细胞内自噬溶酶体通路功能障碍、引起α-synuclein蛋白异常蓄积。PP242可完善自噬溶酶体通路从而促进α-synuclein的降解。
【关键词】：自噬 α-synuclein 溶酶体 TNF
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 研究背景9-13
• 参考文献10-13
• 材料和方法13-24
• 结果24-32
• 讨论32-35
• 结论35-36
• 参考文献36-40
• 综述40-46
• 参考文献43-46
• 中英文对照缩略词表46-47
• 攻读学位期间公开发表的论文及科研成果47-48
• 致谢48-49

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本文编号：774413