解偶联蛋白2通过线粒体介导参与高血糖加重脑缺血再灌注损伤的实验研究

发布时间：2017-09-09 14:18

  本文关键词：解偶联蛋白2通过线粒体介导参与高血糖加重脑缺血再灌注损伤的实验研究

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【摘要】：目的糖尿病高血糖加重脑缺血再灌注损伤,促进缺血后线粒体相关的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)产生。解偶联蛋2(Uncoupling protein 2,UCP2)是线粒体内膜蛋白,它容许H+穿越线粒体内膜而降低线粒体H+梯度,从而稳定线粒体内膜电位和减少ROS的产生。但目前UCP2在高血糖加重脑缺血损伤中的作用以及其调节途径尚不清楚。本实验研究拟采用敲除UCP2基因小鼠(KO-UCP2)模拟糖尿病高血糖和脑缺血再灌注损伤状态,探讨敲除UCP2基因是否增加神经元损伤及其可能的分子通路。方法将雄性敲除UCP2基因小鼠(KO-UCP2)及野生型C57BL/6j小鼠分为野生型小鼠正常血糖脑缺血再灌注组(CN组)、KO-UCP2小鼠正常血糖脑缺血再灌注组(KN组)、KO-UCP2小鼠正常糖尿病高血糖脑缺血再灌注组(KH组)。采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)制备Ⅰ型糖尿病小鼠模型,通过大脑中动脉缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)建立局灶性脑缺血再灌注模型。通过病理组织学、免疫组织化学、免疫荧光、TTC染色、原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸(d UTP)标记法(TUNEL)、RT-PCR、Western blot方法,对比观察各组神经元形态变化、细胞凋亡及Cyt C、Cleaved Caspase-9、Caspase-3的表达。结果(1)再灌注24h,KN组神经功能评分高于CN组,KH组神经功能评分明显高于KN组(P0.05)。(2)TTC染色结果,再灌注24h,KN组梗死面积大于CN组,KH组梗死面积明显大于KN组(P0.05)。(3)组织学结果,缺血中心区,正常血糖CN、KN组再灌注6h部分神经元核固缩、肿胀,间质水肿;再灌注24h,神经元变性坏死加重,部分神经细胞消失,结构破坏,形态不规则;再灌注72h,缺血中心区坏死的神经细胞脱落,出现炎性细胞和大量胶质细胞。在相同再灌注时间高血糖组损伤更为明显。缺血周围区,正常血糖CN、KN组再灌注6h,出现脑水肿表现;再灌注24h,缺血周围区界限清晰可辨,部分神经元变性坏死,间质疏松呈网格状改变,水肿明显;再灌注72h水肿明显改善,可见大量胶质细胞浸润。与正常血糖组相比,KH组水肿和细胞损伤情况更为严重。(4)TUNEL染色结果,再灌注24h TUNEL阳性表达明显增加,KN组凋亡指数高于CN组,KH组明显高于KN组(P0.05);再灌注72h TUNEL阳性表达下降,KH组凋亡指数明显高于KN组(P0.05)。(5)Cyt C、Caspase-3免疫组化结果。再灌注6h开始出现Cyt C、Caspase-3阳性细胞表达;再灌注24h达到高峰,KN组阳性表达高于CN组,KH组明显高于KN组(P0.05);再灌注72h阳性表达下降,KN组高于CN组,KH组Caspase-3阳表达高于KN组(P0.05)。(6)Cleaved Caspase-9免疫荧光染色及双标结果。再灌注6h阳性细胞开始表达,24h达到高峰随后下降。再灌注6、24、72h,KN组阳性细胞数及免疫荧光双标数高于CN组,KH组明显高于KN组(P0.05)。(7)RT-PCR检测结果。再灌注6h Cyt C、Caspase-9、Caspase-3m RNA表达开始升高,KH组表达量明显高于KN组;再灌注24h达高峰,KN组表达量明显高于CN组,KH组明显高于KN组(P0.05);再灌注72h下降KN组Cyt C、Caspase-9m RNA表达量明显高于CN组,KH组Caspase-3m RNA表达量明显高于KN组(P0.05)。(8)Western Blot结果再灌注6h时Cyt C出现表达,KN组明显高于CN组(P0.05);再灌注24h表达升高达到高峰,KN组Cyt C表达明显高于CN组,KH组明显高于KN组;72h时下降,KH组表达明显高于KN组(P0.05)。结论(1)糖尿病高血糖加重局灶性脑缺血再灌注损伤,导致缺血面积增大、神经功能损伤增加、缺血周围脑皮质区细胞凋亡增加。(2)敲除UCP2基因加重局灶性脑缺血再灌注损伤,使得缺血区面积扩大、脑水肿及神经元固缩增加。(3)在敲除UCP2基因加重脑缺血再灌注损伤的基础上,高血糖进一步加重脑损伤。可能机制与高血糖进一步上调Cyt C,Cleaved Caspase-9、Caspase-3表达有关,线粒体凋亡通路激活程度增加,通过线粒体凋亡通路Caspase途径诱导细胞凋亡加重损伤。
【关键词】：糖尿病高血糖 脑缺血再灌注 UCP2 线粒体 细胞凋亡
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1;R743
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 缩略词表9-11
• 前言11-14
• 材料与方法14-26
• 结果26-37
• 讨论37-44
• 结论44-45
• 附图45-49
• 参考文献49-58
• 文献综述58-76
• 参考文献68-76
• 致谢76-77
• 攻读学位期间发表的学术论文目录77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：820928