神经粘附分子NB3对缺氧下脑血管内皮细胞的调节作用

发布时间：2017-09-13 22:32

  本文关键词：神经粘附分子NB3对缺氧下脑血管内皮细胞的调节作用

  更多相关文章： NB3 contactin 6 缺氧 脑血管内皮细胞 通透性 紧密连接

【摘要】：高原脑水肿是由急性缺氧引起的中枢神经系统功能严重障碍,临床表现为严重头痛、呕吐、共济失调,甚至昏迷、死亡,且致死率可高达40%,目前关于高原脑水肿的发病机制仍不清楚。在高原极端环境下,缺氧作为重要的致病因素,破坏血脑屏障完整性,促使血管源性脑水肿发生,是高原脑水肿发生的主要原因。血脑屏障是维持中枢神经系统内环境稳态的重要结构,其中脑血管内皮细胞及其细胞间的紧密连接是维持血脑屏障功能的关键。因此,探讨缺氧对脑血管内皮细胞及其细胞间紧密连接的影响对于高原脑水肿发病机制的研究具有重要的意义。神经粘附分子NB3,也称contactin 6,是F3/contactin家族神经识别分子成员之一,在神经发育方面有重要作用。本实验室的前期研究发现:NB3敲除小鼠急性缺氧后存活率明显降低,加速了小鼠在高原缺氧下的死亡,且对伊文思蓝的通透性显著高于野生小鼠,推测NB3可能对血脑屏障具有一定的调节作用。基于实验室的前期工作,本研究的主要科学问题是神经粘附分子NB3是否参与缺氧下血脑屏障通透性的调节,其作用机制如何?本研究利用NB3基因敲除小鼠探讨其对缺氧下血管内皮细胞中的调节作用。主要内容包括(1)明确NB3在神经系统不同类型细胞中的表达和定位。(2)体外培养的小鼠脑血管内皮细胞,研究缺氧对中NB3表达和细胞紧密连接和通透性的影响。(3)NB3缺失或补充NB3对缺氧下小鼠脑血管内皮细胞紧密连接和通透性的影响。最后探讨神经粘附分子NB3在脑血管内皮细胞中可能的作用方式。具体研究结果如下:1.神经粘附分子nb3在神经-血管单元中的表达和定位:血脑屏障由多种细胞构成,包括脑血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞。首先,我们利用westernblot和免疫荧光的方法观察了nb3在神经-血管单元不同类型细胞中的表达定位,结果显示nb3在神经元和脑血管内皮细胞有明显表达,但在星形胶质细胞不表达,提示nb3在脑血管内皮细胞中具有一定作用。2.缺氧对脑血管内皮细胞nb3表达及对细胞紧密连接和通透性的影响:westernblot和实时定量pcr结果显示,随着缺氧时间的延长,nb3在转录和翻译水平表达明显下降;同时细胞紧密连接相关蛋白zo-1,occludin,claudin5,ve-cadheren表达降低。跨内皮细胞电阻值(transendothelialelectricalresistant,teer)的测定结果显示,随着缺氧时间的延长,脑血管内皮细胞teer值逐渐降低,通透性增加。提示nb3可能参与调节细胞的紧密连接影响内皮细胞的通透性。3.nb3缺失对缺氧下脑血管内皮细胞紧密连接和通透性的影响:我们进一步原代分离培养nb3缺失的脑血管内皮细胞,检测nb3缺失的脑血管内皮细胞在缺氧下teer值和荧光素钠通透性。结果显示nb3的缺失加重缺氧导致的脑血管内皮细胞通透性增加。westernblot和免疫荧光结果显示,nb3的缺失加重缺氧导致的紧密连接蛋白claudin5和zo-1表达降低,进一步证明nb3可能通过调节细胞紧密连接影响内皮细胞通透性。4.补充nb3蛋白对缺氧下脑血管内皮细胞紧密连接和通透性的影响:包被或添加可溶性nb3蛋白后检测缺氧下脑血管内皮细胞的通透性,结果显示补充nb3蛋白可降低缺氧导致的内皮细胞通透性增加,免疫荧光显示nb3促进缺氧下紧密连接蛋白的表达,证明nb3在缺氧下对脑血管内皮细胞具有保护作用,同时提示nb3可能通过同亲嗜性相互作用而发挥其该保护作用。本研究首次发现神经粘附分子nb3在脑血管内皮细胞中表达,nb3缺失加重缺氧对脑血管内皮细胞紧密连接的破坏,血管通透性增加,加重了脑损伤,而补充nb3蛋白可有效降低缺氧对脑血管内皮细胞的损伤。证明nb3是缺氧下脑血管内皮细胞重要的内源性保护分子,为研究高原脑水肿的发病机制提供新线索,为预防和治疗高原缺氧脑损伤提供新思路。
【关键词】：NB3 contactin 6 缺氧 脑血管内皮细胞 通透性 紧密连接
【学位授予单位】：首都医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-16
• 材料与方法16
• 1. 实验材料16-21
• 1.1. 原代细胞和细胞株16
• 1.2. 实验动物16
• 1.3. 实验仪器设备16-17
• 1.4. 主要试剂及配方17-21
• 1.4.1. 抗体17-18
• 1.4.2. 常用试剂18-19
• 1.4.3. 主要试剂配制19-21
• 2. 实验方法21-31
• 2.1. 小鼠DNA提取及基因型鉴定21-23
• 2.2. 原代脑血管内皮细胞提取23-24
• 2.3. 细胞培养24
• 2.3.1. BMEC细胞培养24
• 2.3.2. 原代脑血管内皮细胞培养24
• 2.4. 细胞的缺氧处理24
• 2.5. 细胞计数24-25
• 2.6. 检测跨内皮细胞电阻(TEER)25
• 2.7. 检测荧光素钠(Na F)通透性25-26
• 2.8. 细胞免疫荧光26
• 2.9. Western Blot检测蛋白表达26-28
• 2.9.1. 细胞总蛋白的提取26
• 2.9.2. 脑组织总蛋白的提取26
• 2.9.3. SDS-PAGE电泳26-28
• 2.10. 实时定量PCR检测m RNA表达28-30
• 2.10.1. RNA的提取28
• 2.10.2. RNA质量的检测28
• 2.10.3. RNA反转录成c DNA28-29
• 2.10.4. 实时定量PCR29-30
• 2.11. 数据处理及统计学分析30-31
• 实验结果31-51
• 一、神经粘附分子NB3在神经-血管单元中的表达31-32
• 二、小鼠脑血管内皮细胞的培养与鉴定32-35
• 2.1. 原代小鼠脑血管内皮细胞的培养32-33
• 2.2. 原代小鼠脑血管内皮细胞的鉴定33-34
• 2.3. 永生化的小鼠脑血管内皮细胞BMEC的鉴定34-35
• 三、缺氧对脑血管内皮细胞通透性和紧密连接的影响35-40
• 3.1. 缺氧增加脑血管内皮细胞的通透性36-37
• 3.2. 缺氧降低脑血管内皮细胞紧密连接相关蛋白及NB3的表达37-40
• 四、补充NB3蛋白对缺氧下脑血管内皮细胞紧密连接和通透性的影响40-44
• 4.1. 可溶性NB3蛋白保护缺氧后脑血管内皮细胞的通透性40-41
• 4.2. 可溶性NB3蛋白促进降低缺氧后脑血管内皮细胞紧密连接的表达41-42
• 4.3. NB3的亲同性作用对缺氧损伤脑血管内皮细胞通透性的影响42-44
• 五、NB3缺失对缺氧下脑血管内皮细胞紧密连接和通透性的影响44-51
• 5.1. NB3基因敲除小鼠鉴定44-45
• 5.2. NB3缺失加重缺氧导致的脑血管内皮细胞通透性增加45-46
• 5.3. NB3缺失加重缺氧对脑血管内皮细胞紧密连接蛋白的破坏46-51
• 5.3.1 NB3缺失加重缺氧导致的脑血管内皮细胞紧密连接蛋白表达下降46-48
• 5.3.2 B3缺失加重缺氧导致的脑血管内皮细胞紧密连接形态学变化48-51
• 讨论51-53
• 结论53-54
• 参考文献54-61
• 文献综述61-74
• 参考文献67-74
• 缩略词表74-76
• 攻读学位期间文章情况76-77
• 致谢77-78
• 个人简历78

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 崔登峰,万琪;构建脑血管内皮细胞紧密连接模型对脑血管疾病发生发展机制研究的意义[J];中国临床康复;2005年09期

2 刘勇，，周敬德，房台生，凌凤东;细胞间粘附分子在脑血管内皮细胞的表达[J];基础医学与临床;1995年02期

3 张洁,邱劲,娄晋宁,王小明,斯琴,吴其夏,郭恒怡;TNF-αⅠ型受体对小鼠脑血管内皮细胞iNOS和HO-1基因表达的影响[J];基础医学与临床;2005年06期

4 柳忠兰,孙大勇,李华,冯昱;烟草烟雾对大鼠脑血管内皮细胞细胞间黏附分子-1表达及脑梗死体积的影响[J];中华神经科杂志;2003年05期

5 刘菲;柳忠兰;刘淑杰;;吸烟大鼠脑血管内皮细胞基质金属蛋白酶9的表达[J];中国动脉硬化杂志;2005年05期

6 魏东宁,朱克;老年人急性脑梗死患者血浆、脑脊液中内皮素1含量测定及其在脑血管内皮细胞水平的研究(论著摘要)[J];中国神经免疫学和神经病学杂志;1998年03期

7 万功山;柳忠兰;曲芸;宋红;白丽虹;曲永瑜;;蛋白激酶C抑制剂对吸烟大鼠脑血管内皮细胞细胞间粘附分子1表达的影响[J];中国动脉硬化杂志;2007年11期

8 薛峥;张苏明;;纤维蛋白对大鼠脑血管内皮细胞白细胞介素6表达的影响[J];中国病理生理杂志;2008年09期

9 刘菲;苏畅;柳宗兰;;卷烟烟气对大鼠脑血管内皮细胞单核细胞趋化蛋白-1表达的影响[J];军事医学科学院院刊;2010年06期

10 姜亚军,何家声;脑缺血再灌注时白细胞与脑血管内皮细胞粘附机制研究进展[J];国外医学(生理、病理科学与临床分册);1996年04期

中国重要会议论文全文数据库 前4条

1 鄂瑞芳;张哲成;;高同型半胱氨酸血症对大鼠脑血管内皮细胞结构及功能的影响[A];第九次全国神经病学学术大会论文汇编[C];2006年

2 余沪荣;沈馨亚;汪洋;;低氧对培养的脑血管内皮细胞影响的观察[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年

3 周厚广;董强;胡仁明;刘玲;杨雪莲;;高糖、高脂及缺氧环境对原代人脑血管内皮细胞周期调控蛋白HCDC14A的影响[A];第十一届全国神经病学学术会议论文汇编[C];2008年

4 何芳;尹飞;彭镜;邓小鹿;杨丽芬;吴丽文;;RhoA和NF-κB参与LPS致脑血管内皮细胞通透性增高的调控[A];中华医学会第十五次全国儿科学术大会论文汇编（上册）[C];2010年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 张国清;脑血管内皮细胞可产生造血细胞[N];中国医药报;2012年

中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 李德生;脑血管内皮细胞凋亡在大鼠蛛网膜下腔出血后血管痉挛中的作用及机制探讨[D];中国人民解放军军医进修学院;2006年

2 刘丽英;NAMPT对脑血管内皮细胞功能及缺血性损伤的作用[D];浙江大学;2013年

3 孙文萍;同型半胱氨酸对脑微血管内皮细胞炎性损伤的实验研究及机制探讨[D];吉林大学;2007年

中国硕士学位论文全文数据库 前9条

1 韩雪;神经粘附分子NB3对缺氧下脑血管内皮细胞的调节作用[D];首都医科大学;2016年

2 鄂瑞芳;高同型半胱氨酸血症对大鼠脑血管内皮细胞结构及功能的影响[D];天津医科大学;2005年

3 徐锦平;烟草烟雾对大鼠脑血管内皮细胞PDGF表达的影响[D];中国医科大学;2004年

4 崔登峰;血脑屏障内皮细胞间紧密连接模型的建立与紧密连接损伤的观察[D];第四军医大学;2005年

5 孙大勇;烟草烟雾对大鼠脑血管内皮细胞ICAM-1mRNA表达的影响[D];中国医科大学;2003年

6 刘菲;P-选择素和基质金属蛋白酶-9在吸烟大鼠脑血管内皮细胞的表达[D];中国医科大学;2002年

7 孙芸;香烟烟雾对大鼠脑血管内皮细胞VCAM-1表达及脑梗死体积的影响[D];中国医科大学;2004年

8 杜宁;低氧脑水肿时脑血管内皮细胞和星形胶质细胞VEGF和AQPs基因和蛋白表达的变化[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年

9 杨德兵;经鼻给予ICAM-1抗体对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用研究[D];山西医科大学;2006年

本文编号：846309