脑白质损伤模型LINGO-1动态变化及低表达LINGO-1的OPCs移植初探

发布时间：2017-09-14 10:18

  本文关键词：脑白质损伤模型LINGO-1动态变化及低表达LINGO-1的OPCs移植初探

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【摘要】：背景脑白质损伤(White matter injury, WMI)是早产儿脑损伤的常见形式,也是造成儿童脑瘫和智障的主要病因之一。随着新生儿重症监护的发展和完善,虽然使早产儿的存活率大大提高,但是目前国内外对于早产儿WMI仍缺乏有效的治疗方法。我国每年新增很多遗留脑瘫或者认知障碍和学习能力低下等后遗症的患儿,给社会和家庭都带来了极大的负担。WMI发病的主要原因是由于脑内少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte Precursor Cells, OPCs)在氧自由基、炎性因子等有害因素攻击下受到一定损伤,导致脑白质髓鞘化延迟或被破坏；少突胶质细胞(Oligodendrocyte, OL)是中枢神经系统(Central nervous system, CNS)的成髓鞘细胞,由OPCs分化而来,OL可包绕神经纤维的轴突而形成髓鞘。WMI患者由于内源性成髓鞘细胞前体细胞(OPCs)大量丢失而出现髓鞘化障碍,要促进其髓鞘再生,最有效、最直接的方法是植入外源性成髓鞘细胞。成熟的OL由于丧失了迁移能力而不适合作为移植的种子细胞,而OPCs因其是CNS中成髓鞘细胞的天然前体细胞,故可作为WMI治疗的最佳种子细胞。尽管OPCs给WMI患者的治疗带来了新的希望,但是目前OPCs移植治疗WMI还存在许多难题,其中影响WMI患者髓鞘再生的主要问题是外源植入OPCs的分化效率极低,难以促进髓鞘再生；移植细胞OPCs作为一种外源物质,微环境对其存活分化极为重要,近年来研究发现了多种负性调节物质对OPCs分化及髓鞘化产生了重要的影响,LINGO-1就是其中的典型代表之一。LINGO-1是一个由LRRN6A基因表达的614个氨基酸组成的跨膜蛋白,特异性表达于CNS的OL和神经元。近年来动物实验研究发现,LINGO-1在OPCs分化和髓鞘形成过程中发挥了重要的调控作用,且LINGO-1是一个关键的负调节因素,神经元轴突和OPCs中LINGO-1表达下调是体内髓鞘化所必需的。但是目前关于LINGO-1对于人源OPCs的存活及分化作用还尚未见报道。综上所述,早产儿WMI治疗的关键是促进其髓鞘再生,外源植入OPCs将会是最直接有效的方法；然而目前影响髓鞘再生的主要问题是外源植入OPCs的存活及分化效率低,而LINGO-1可能是突破这一瓶颈问题的关键因素之一。本文旨在通过建立3日龄新生SD大鼠缺氧缺血性WMI模型,并探究造模后不同时间窗LINGO-1的动态变化情况,同时构建人源LINGO-1慢病毒干扰载体,将经过慢病毒干扰后低表达LINGO-1的人源OPCs移植入WMI模型中,对细胞植入后存活,迁移及分化情况进行初步探究。第一章3日龄新生SD大鼠缺氧缺血性WMI模型的建立及其LINGO-1动态变化研究目的建立3日龄新生SD大鼠缺氧缺血性WMI模型并探究其LINGO-1动态变化情况。方法3日龄新生SD大鼠共计84只,随机分为2个组：模型组(White matter injury,WMI组；n=42只),采用结扎右侧颈总动脉联合缺氧的方法建立缺氧缺血性WMI模型,假手术组(Sham-operated group, Sham组,n=42只),仅分离右侧颈总动脉不作结扎处理,两组动物再分别根据不同时间窗(1天、3天、7天、14天、21天、28天)随机分为6个亚组,每组n=6只；WMI组和Sham组分别随机抽取6只用于模型鉴定,通过脑组织病理形态变化、髓鞘碱性蛋白MBP损伤程度以及早期运动功能障碍评估三个方面对模型进行鉴定,并从不同时间窗探究造模后LINGO-1蛋白动态表达情况。结果1.造模7天后I-IE染色结果：Sham组无细胞肿胀、坏死病理改变,WMI组手术侧整个大脑皮层下白质较Sham组细胞,细胞稀疏、胞体肿胀、间隙增宽、排列紊乱,并可见微小梗死灶,整体呈现选择性白质损伤,染色结果与早产儿WMI病理学特征类似。2.免疫组化染色MBP表达情况：WMI组手术侧白质区外囊和与之垂直的突起髓鞘明显丢失；Sham组手术侧白质没有明显髓鞘丢失。3.不同时间窗LINGO-1动态表达情况：造模后不同时间窗的qPCR结果显示：WMI组动物造模1天后,LINGO-1 mRNA相对表达量较Sham组即开始明显增高(3.79±0.30),并于7天时相对表达量达峰值(6.64±0.25),此后开始呈逐渐下降趋势,21天时相对表达量较高峰期己大幅下降(2.57±0.47),三个时间点与Sham组比较差异均具有统计学意义(p0.05)。至28天时WMI组表达已基本接近Sham组,与Sham组比较差异无统计学意义(p0.05)。Western blot结果也得到相同结论,LINGO-1表达量上调的最高峰于WMI造模后7天出现,且表达量总体变化趋势与qPCR结果基本相同。4.早期运动功能障碍评估：斜坡试验评分：WMI组左侧肢体(结扎动脉对侧)均出现轻度的运动功能障碍,斜坡试验检测评分结果,WMI组和Sham组间的差异具有统计学意义,p0.05。结论成功建立3日龄新生SD大鼠缺氧缺血性WMI模型,病理学及行为学改变与早产儿WMI临床特征相似；造模后LINGO-1蛋白动态变化呈规律性、病理性升高,且于造模后7天达峰值。第二章人源LINGO-1慢病毒干扰载体的构建与鉴定目的 体外构建人源LINGO-1特异性慢病毒干扰载体,并测定其对靶基因LINGO-1的干扰效率,筛选出干扰效率最高的慢病毒干扰序列。方法 根据GenBank报道的人源LINGO-1基因序列,设计合成3对针对人源LINGO-1 shRNA的干扰序列,分别对应shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组,同时设计一条阴性对照序列shRNA4组(无靶向随机打散序列),克隆至重组质粒载体并进行基因测序,验证重组载体序列与合成的干扰载体框架是否一致；将测序正确的质粒载体在293T细胞内包装成慢病毒并测定各组病毒原液滴度。体外培养人胶质细胞瘤细胞U251,经各组慢病毒载体转染后,计算转染效率,并通过免疫荧光染色、qPCR和Western blot检测各组慢病毒载体的干扰效率。结果1.重组载体测序、包装及滴度测定：构建的慢病毒干扰载体经基因测序仪测序,结果与设计序列完全一致,说明含所设计干扰序列的载体构建成功；质粒载体经过包装后均获得了较高滴度的病毒原液,各组病毒原液滴度分别为shRNA1组=4E+8TU/ML、shRNA2组=2E+8TU/ML、shRNA3组=1E+8TU/ML、shRNA4组=3E+8TU/ML。2.免疫荧光染色结果：病毒载体感染人胶质细胞瘤细胞U251后,各组GFP阳性细胞数高达96%以上。进一步进行免疫荧光染色,其中shRNA3组细胞较其它组免疫荧光呈现减弱现象,可间接说明shRNA3序列慢病毒干扰载体干扰LINGO-1蛋白效果明显。3.qPCR结果：慢病毒载体感染的各组U251细胞中LINGO-1 mRNA相对表达量为：shRNA1组=0.88±0.03、shRNA2组=0.31±0.02、shRNA3组=0.18±0.03、shRNA4组=1.00±0.00,其中shRNA3组LINGO-1 mRNA相对表达量较其它组明显降低,与shRNA4组比较,p0.01,差异具有统计学意义,即shRNA3组mRNA相对shRNA4组降低了82%。4.Western blot结果：灰度扫描结果显示,各组LINGO-1蛋白表达量较对照组明显降低,其中shRNA3组(shRNA3=0.28±0.03)蛋白表达量较其它组最少,与shRNA4 (shRNA4=1.00±0.00)比较差异具有统计学差异,p0.01；进一步说明设计的各组干扰载体中shRNA3慢病毒干扰载体干扰效果最佳。结论我们成功构建了人LINGO-1 shRNA慢病毒干扰载体,并筛选出了干扰效率载体最佳的载体,为后续试验及研究LINGO-1在轴突再生中的作用奠定了基础。第三章低表达LINGO-1人源OPCs移植入脑白质损伤模型初探目的探究低表达LINGO-1人源OPCs移植入WMI模型后存活、迁移及分化情况。方法利用人源神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)诱导获得OPCs,利用免疫荧光染色鉴定OPCs特异性标志物；将高纯度OPCs经shRNA3序列慢病毒(MOI=10)转染后,计算GFP阳性细胞数；经qPCR检测其LINGO-1表达情况,验证其干扰效率。OPCs经过转染后,于WMI造模7天后进行移植,OPCs经立体定位移植,植入模型皮层下白质区,移植后分别于1、2、4周进行灌注取脑,固定脱水后制作冠状面冰冻切片,荧光显微镜下观察移植细胞的存活、迁移及分化情况；移植4周后根据细胞存活情况,取材进行MBP染色判断损伤白质的改善程度。结果1.NSCs诱导获得OPCs:神经干细胞经OPCs诱导培养基诱导培养,获得高纯度OPCs, OPCs经免疫荧光染色,其细胞亚群高表达OPCs的标志物O4,PDGFaR和Sox10,仅有极少数细胞表达星形胶质细胞标志物GFAP和神经元标志Tuj-1。2.OPCs转染及干扰效率：诱导获得的高纯度OPCs经含shRNA3序列的慢病毒转染,荧光显微镜结果显示GFP阳性细胞数高达98%以上。qPCR结果显示：shRNA3序列慢病毒干扰载体有效降低OPCs LINGO-1表达,干扰效率达84%。3.OPCs移植后情况：移植后1周移植动物模型灌注取脑制备冰冻切片,荧光显微镜下观察GFP标记的移植细胞,结果显示shRNA3'慢病毒OPCs移植组移植的细胞可在宿主脑组织中存活,细胞主要围绕于注射针孔部位；shRNA4厦病毒OPCs移植组同样可见移植细胞大量聚集在注射针孔部位；两组移植细胞均未发生明显的迁移。细胞移植2周后,移植动物模型采用相同的方法制备冰冻切片,荧光显微镜下观察发现,shRNA3陧病毒OPCs移植组移植OPCs细胞依旧围绕注射针孔附近,较一周时细胞有所位移,却未发生明显迁移现象,但细胞数量有所减少；shRNA4慢病毒OPCs移植组细胞明显减少。移植后4周继续观察移植OPCs细胞的情况,多只同批移植模型鼠均未发现GFP标记的OPCs细胞。结论成功将干扰效率最高的慢病毒干扰载体转染入待移植OPCs,并干扰降低了OPCs的LINGO-1蛋白表达；移植后低表达LINGO-1的OPCs短期内可以大量存活,但是长期存活存在障碍,且并未发生明显的迁移分化。
【关键词】：WMI LINGO-1 慢病毒载体 OPCs 细胞移植
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R-332;R742
【目录】：

• 中文摘要3-9
• ABSTRCT9-18
• 前言18-22
• 第一章 3日龄SD大鼠缺氧缺血性WMI模型的建立及其LINGO-1动态变化研究22-35
• 1. 材料22-23
• 2. 方法23-28
• 3. 结果28-32
• 4. 讨论32-33
• 5.小结33-35
• 第二章 人源LINGO-1慢病毒干扰载体的构建与鉴定35-54
• 1. 材料35-36
• 2. 方法36-47
• 3. 结果47-51
• 4. 讨论51-53
• 5 小结53-54
• 第三章 低表达LINGO-1人源OPCs移植入脑白质损伤模型初探54-65
• 1. 材料54
• 2. 方法54-57
• 3. 结果57-61
• 4. 讨论61-64
• 5.小结64-65
• 参考文献65-73
• 附录73-83
• 中英文对照缩略词表83-84
• 硕士期间发表论文84-85
• 致谢85-86

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