新生大鼠小胶质细胞的分离纯化、培养及鉴定

发布时间：2017-09-15 01:11

  本文关键词：新生大鼠小胶质细胞的分离纯化、培养及鉴定

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【摘要】：目的：探讨原代小胶质细胞纯化分离培养的方法,从而建立一种简易的、高产量的、高纯度的连续获得小胶质细胞的体外培养模型,同时建立小胶质细胞活化的模型,为小胶质细胞移植治疗帕金森病的相关实验提供足够细胞材料。方法：1.混合胶质细胞的培养：取新生1-2d SD大鼠,酒精浸泡消毒,断头处死,冷D-Hanks反复冲洗,显微镜下取两侧大脑半球,剔除脑膜、血管,剪碎脑组织,加入胰蛋白酶消化,再加入DMEM/F12终止消化,过滤,离心,弃上清液,重新制成细胞悬液,细胞计数并调整细胞密度至10×105/ml接种于3个预先涂有多聚赖氨酸的培养瓶中,随机分成A、B、C三组,同一恒温培养箱培养,24h后完全换液,3d换液1次,半量换液。2.小胶质细胞的分离纯化：待混合培养第7-9d,将随机分成的三组细胞分离纯化,A组：恒温振荡法；B组：温和胰酶消化法；C组：利多卡因分离法。加入培养基重新吹打成细胞悬液,台盼蓝拒染试验分别检测细胞存活率,利用细胞计数板计数并调整细胞密度至1×105/ml接种于预先放有盖玻片(多聚赖氨酸包被)的相应A、B、C三个6孔培养板中,30min后完全换液一次,去除未贴壁细胞,再加入新培养液,放入同一恒温培养箱培养继续培养。24h后完全换液,3d换液1次。3小胶质细胞的鉴定：待分离纯化继续培养9d后,再利用CDllb (0X42)免疫荧光染色对分离纯化的小胶质细胞纯度进行鉴定。4.脂多糖诱导小胶质细胞：收集原代小胶质细胞接种于标记6孔培养板。1、3、5分为A组,加入DMEM/F12培养液,作为对照组；2、4、6孔分为B组,加入预先加入了脂多糖的DMEM/F12培养液,于恒温培养箱内培养24h后观察。结果：1.混合胶质细胞的培养：显微镜下观察可发现培养1～2d,混合胶质细胞数量变化不大。小胶质细胞胞体较大,有许多细胞碎片。3～4d,星形胶质细胞分裂进入对数增长期,逐渐成层。小胶质细胞数量无明显改变,但胞体明显增大,折光性变化更为明显,但折光性不均。5～6d,星形胶质细胞数目持续增多,形成较明显的底层,而同期小胶质细胞数目也出现明显的增多,均匀分布于上层,形态呈圆形阿米巴样。7～9d,细胞分层明显,细胞数量变化不大。2小胶质细胞的分离纯化存活率检测：三种方法分离纯化后,离心收集小胶质细胞,台盼蓝拒染试验检测细胞存活率分别为：A组：(92.58±2.62)%,B组：(93.61±1.62)%,C组：(92.97±1.54)%。3小胶质细胞分离纯化鉴定：CD11b(OX42)免疫荧光染色小胶质细胞的纯度鉴定分别为：A1组：(90.73±0.36)%,B1组：(96.19±3.31)%,Cl组：(97.63±2.28)%,A2,B2,C2阴性对照无特异性染色。显微镜下观察细胞形态,分离纯化第1d小胶质细胞呈圆形阿米巴样,基本无改变,继续培养3-5d,小胶质细胞逐渐出现突起,且可见少量分支状小胶质细胞,培养7～9d时部分细胞转为静息状态。4.脂多糖刺激后,小胶质细胞处于激活状态的数目明显增多,炎症因子释放增多。结论：1.本实验观察到了小胶质细胞的两种形态,并发现在小胶质细胞体外培养过程中,其形态是先激活(阿米巴样)再静息(分支状)的。2.本实验通过对三种纯化分离方法的对比分析,发现利多卡因分离法、温和胰酶消化法获得细胞数及纯度均高于恒温振荡法,因此应在与小胶质细胞有关的实验研究工作中得到推广,本实验也为研究小胶质细胞功能奠定了基础。3.本实验分离培养的细胞经过小胶质细胞特异性标志物CD11b(OX42)免疫细胞荧光染色结果均呈阳性,且纯度均较高,证明本实验方法能在体外培养出高纯度的小胶质细胞。4.本实验分离培养的小胶质细胞能够被脂多糖诱导激活释放炎症及神经营养因子,证明此种方法培养的MG生物活性得以保留,可以建立活化模型。
【关键词】：小胶质细胞 分离 培养 鉴定 帕金森病
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.5
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 符号说明11-13
• 引言13-18
• 材料与方法18-27
• 1. 材料18-20
• 1.1 主要仪器设备18-19
• 1.2 实验试剂及材料19
• 1.3 实验动物19
• 1.4 主要溶液配制19-20
• 2. 方法20-27
• 2.1 混合胶质细胞培养及形态观察20-22
• 2.2 小胶质细胞的分离纯化22-24
• 2.3 细胞计数及台盼蓝染色实验24
• 2.4 小胶质细胞的鉴定24-25
• 2.5 小胶质细胞活化模型的建立25-26
• 2.6 统计学处理26-27
• 结果27-41
• 1 混合胶质细胞的培养27-29
• 2 小胶质细胞分离纯化29-32
• 3 细胞计数及台盼蓝细胞拒染实验32-34
• 4 免疫荧光染色鉴定34-36
• 5 小胶质细胞活化模型分析36-41
• 讨论41-47
• 结论47-48
• 参考文献48-53
• 文献综述53-62
• 参考文献59-62
• 论文发表情况62-63
• 致谢63

【参考文献】

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1 黄丹宇;叶民;;小胶质细胞与帕金森病(英文)[J];中国组织工程研究;2012年24期

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本文编号：853417