低氧诱导因子HIF3α在神经管畸形中的表达及作用分析

发布时间：2017-09-16 16:30

  本文关键词：低氧诱导因子HIF3α在神经管畸形中的表达及作用分析

  更多相关文章： 维甲酸 神经管畸形 HIF3α BNIP3 细胞凋亡

【摘要】：目的:探讨低氧诱导因子在神经管畸形中的作用及其可能的机制。首先使用维甲酸建立神经管畸形(NTDs)动物模型,取NTDs胚胎脑组织进行转录组测序,经过生物信息学分析后得到低氧诱导因子HIF3α与基因BNIP3表达发生变化,所以将其作为本次实验的主要研究靶点。其次,通过使用维甲酸体外干预PC12细胞,在细胞水平探讨靶基因HIF3a与BNIP3以及细胞凋亡之间的相互关系,进而揭示其在神经管畸形发生发展过程中的作用和可能的机制。方法:1.在C57BL/6J小鼠怀孕7.5天(E7.5)时通过灌胃将一定量的维甲酸注入小鼠体内,造成胚胎神经管畸形(NTDs)的模型;造模成功后取E10.5天胚胎脑组织进行转录组测序并分析测序结果,发现在神经管畸形的形成过程中低氧诱导因子HIF1a、HIF3a及相关下游基因BNIP3的表达发生了改变。2.通过实时定量聚合酶链反应Real-time PCR检测胚胎脑组织中HIF1a、HIF3a、BNIP3 mRN A表达情况,即对测序结果进行了验证。3.在细胞水平进一步验证,通过使用不同浓度维甲酸(0μM、20μM、40μM)在体外对PC12细胞干预培养,采用Real-time PCR和Western blotting检测靶基因在细胞中的表达变化;4.为研究靶基因变化与细胞凋亡的关系,使用流式细胞仪分别检测不同浓度维甲酸干预后细胞的凋亡情况、产生活性氧的变化以及细胞线粒体膜电位的变化情况;5.为进一步研究HIF3a和BNIP3以及细胞凋亡机制之间的相互关系,通过使用脂质体将化学合成的siRNA转染进PC12细胞干扰HIF3α的表达,抑制了HIF3α表达后,将细胞分为四组,即正常对照组、维甲酸干预组,HIF3αsiRNA细胞转染组和hif3αsirna细胞转染后再加维甲酸干预组,采用real-timepcr和westernblotting检测分析bnip3的表达变化;6.使用流式细胞仪分别检测四组细胞的凋亡情况;7.对四组细胞进行活化的caspase3染色,在荧光显微镜下观察各组caspase3的激活情况。结果:1.使用21mg/kg剂量的维甲酸,小鼠胚胎神经管畸形造模成功,对照组胚胎整体形态完整,轮廓、体节清晰,体积较大,脑部充盈饱满,畸形组胚胎体积较小,体节不明显,常有脑部发育不足或脑膨出,测序分析得到畸形组低氧诱导因子hif1a表达下降,差异无统计学意义,hif3a、bnip3表达升高,差异有统计学意义;2.real-timepcr检测结果与测序结果一致,畸形组低氧诱导因子hif1α表达下降,差异无统计学意义,hif3α、bnip3表达升高,差异有统计学意义,推测hif3a、bnip3可能与ntds的有关;3.在细胞水平上,通过real-timepcr和westernblotting的结果分析得到,细胞中hif3α、bnip3随着使用维甲酸剂量的加大表达升高,与体内组织中的实验结果一致。4.流式的细胞分析结果显示,使用维甲酸的剂量越大,细胞凋亡越多,产生的活性氧越多,细胞线粒体膜电位越低,表明维甲酸可能是通过上调靶基因表达诱导细胞凋亡。5.通过脂质体转染sirna进pc12细胞,转染效率一般为70%左右,干扰hif3α的表达抑制了bnip3的表达以及维甲酸诱导的bnip3表达的升高;6.流式结果显示,干扰hif3α的表达抑制了维甲酸诱导的细胞凋亡,由此说明,维甲酸诱导的细胞凋亡是通过hif3α调控bnip3实现的。7.维甲酸能够激活caspase3,干扰hif3α能在一定程度上抑制对caspase3的活化。结论:维甲酸诱导HIF3α、BNIP3表达升高并激活caspase3,HIF3α通过调控BNIP3的表达从而影响细胞凋亡。
【关键词】：维甲酸 神经管畸形 HIF3α BNIP3 细胞凋亡
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R748
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 常用缩写词中英文对照表12-14
• 前言14-16
• 第一章 HIF3α、BNIP3在神经管畸形中表达的初步分析及验证16-27
• 1 实验材料16-17
• 1.1 实验动物16
• 1.2 实验试剂16
• 1.3 主要仪器和器材16-17
• 1.4 试剂配制17
• 2 实验方法17-20
• 2.1 动物神经管畸形模型的建立17-18
• 2.2 转录组测序18
• 2.3 Real-time PCR验证胚胎脑组织中HIF1a、HIF3a、BNIP3的表达水平18-20
• 2.4 统计方法20
• 3 实验结果20-25
• 3.1 神经管畸形模型的建立20-21
• 3.2 测序结果21-22
• 3.3 Real-time PCR验证胚胎脑组织中HIF1a、HIF3a、BNIP3表达情况22-25
• 4 讨论25-27
• 第二章 低氧诱导因子HIF3α 通过调控BNIP3引起PC12细胞凋亡27-53
• 1 实验材料27-29
• 1.1 实验试剂27-28
• 1.2 主要仪器和器材28-29
• 1.3 试剂配制29
• 2 实验方法29-36
• 2.1 PC12细胞的培养29-30
• 2.2 维甲酸干预细胞引起细胞凋亡30-32
• 2.3 HIF3α、BNIP3随加入维甲酸浓度的增加表达增高32-34
• 2.4 HIF3αsiRNA细胞转染34-35
• 2.5 HIF3α siRNA转染细胞后，，BNIP3表达水平及细胞凋亡的测定35-36
• 2.6 统计方法36
• 3 实验结果36-50
• 3.1 不同浓度维甲酸干预细胞36-37
• 3.2 HIF3α、BNIP3在维甲酸干预后的PC12细胞中表达的研究37-39
• 3.3 维甲酸诱导细胞凋亡39-40
• 3.4 维甲酸诱导使细胞产生的活性氧含量增高40-41
• 3.5 维甲酸诱导细胞线粒体膜电位降低41-43
• 3.6 HIF3αsiRN A细胞转染43-45
• 3.7 HIF3α 干扰后抑制了BNIP3在PC12细胞中的表达45-46
• 3.8 HIF3α 干扰后抑制了维甲酸诱导的细胞凋亡46-48
• 3.9 HIF3α 干扰后抑制了维甲酸对caspase3的活化48-50
• 3.10 总结50
• 4 讨论50-53
• 参考文献53-57
• 综述57-69
• 参考文献63-69
• 致谢69-70
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果70-71
• 个人简历71

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 ;慈善救助神经管畸形残疾儿爱心大行动[J];中国妇幼保健;2002年11期

2 王丽娜;中国30个县8年神经管畸形变化趋势[J];中国生育健康杂志;2003年03期

3 陈乾;靳文;赵瑞珍;;神经管畸形患儿临床诊治及相关因素分析[J];中国妇幼保健;2006年15期

4 范金蝉;;娄烦地区神经管畸形的发病率及预防[J];中国优生与遗传杂志;2011年11期

5 刘庆莲;;神经管畸形病因及其防治的初步探讨(附55例分析)[J];河北医药;1989年04期

6 朱慧萍;;受孕前后期补充维生素对预防神经管畸形初发的作用[J];国外医学.妇幼保健分册;1993年03期

7 郭晓霞,高原原,詹思延,郭艳梅,王砚英,李立明;5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶多态性和神经管畸形的病例对照研究[J];疾病控制杂志;2000年03期

8 马宝珍,潘宝珍;神经管畸形102例分析[J];中国优生与遗传杂志;2000年01期

9 陈新;妇女增补叶酸预防神经管畸形的推广研究获国家“九五”攻关先进个人和优秀科技成果奖[J];中华流行病学杂志;2001年04期

10 王晓明;推广使用叶酸增补剂预防神经管畸形[J];江苏预防医学;2001年04期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 邱兴华;马瑾;任爱国;靳蕾;朱彤;;胎儿子宫内持久性有机污染物暴露与神经管畸形风险[A];第六届全国环境化学大会暨环境科学仪器与分析仪器展览会摘要集[C];2011年

2 李冠男;;山西省出生缺陷高发区DNA修复基因LIG3单核苷酸多态性与神经管畸形的易感性研究[A];中华医学会第十七次全国儿科学术大会论文汇编（下册）[C];2012年

3 郭金;陈晓丽;雷云平;邹继珍;卢晓琳;包怡华;吴丽华;吴建新;郑晓英;沈一平;吴柏林;张霆;;神经管畸形胚胎脑组织DNA整体甲基化水平的病例对照研究[A];中华医学会第十五次全国儿科学术大会论文汇编（上册）[C];2010年

4 梁秀芬;朱坤仪;;超声诊断胎儿神经管畸形的作用[A];庆祝中国超声医学工程学会成立20周年——第八届全国超声医学学术会议论文汇编[C];2004年

5 龙治峰;谢远杰;莫中成;赵国军;;BMP2在热应激导致小鼠神经管畸形发生中的表达及意义[A];中国解剖学会第十一届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会论文汇编[C];2009年

6 赵国军;莫中成;谢远杰;龙治峰;;转化生长因子beta在热应激导致小鼠神经管畸形发生中的表达[A];中国解剖学会第十一届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会论文汇编[C];2009年

7 杨相花;宋玉霞;吴大东;;超声诊断54例胎儿神经管畸形分析[A];第三届计划生育与生殖健康学术交流大会论文汇编[C];2005年

8 刘文静;张淑娟;张天亮;王力;李锋杰;于丽;;p-ERK在高温致金黄地鼠神经管畸形神经上皮细胞中的表达变化[A];中国解剖学会2012年年会论文文摘汇编[C];2012年

9 董玉秀;;胎儿神经管畸形的B超诊断[A];职工医院医学理论与实践[C];1998年

10 关涛;赵婕;牛勃;;抗叶酸代谢药MTX诱导神经管畸形动物模型及其对基因组稳定性的影响[A];泛环渤海地区九省市生物化学与分子生物学会——2011年学术交流会论文集[C];2011年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 记者 付东红;神经管畸形与环境污染相关[N];健康报;2011年

2 傅冬红;北大神经管畸形相关研究取得突破[N];中国医药报;2001年

3 刘桥斌;5小时大婴儿矫治神经管畸形[N];健康时报;2007年

4 孙国根;我国首次在人类胚胎中发现导致神经管畸形的突变基因[N];中国医药报;2010年

5 本报记者　黄 丹;叶酸缺乏和神经管畸形[N];中国中医药报;2002年

6 上海医科大学妇产科医院 黄敏丽 教授;能预防先天性畸形[N];医药经济报;2001年

7 宋芳;孕妇增补叶酸 婴儿减少畸形[N];江苏科技报;2001年

8 新华社记者 宋芳 葛素红;爱心列车送爱心[N];新华每日电讯;2001年

9 记者 李荔;任爱国：追踪胎儿畸形“凶手”[N];北京科技报;2011年

10 ;叶酸为生命起航扬帆[N];大众科技报;2003年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 姚琳;人类多能干细胞在神经管畸形发生及预防机制研究中的应用[D];第二军医大学;2013年

2 谭蕊蓉;高糖诱导神经管畸形的鸡胚模型建立及肌肽的干预作用[D];暨南大学;2015年

3 高永辉;PARD3基因单核苷酸多态性和拷贝数变异与神经管畸形发生的相关性研究[D];北京协和医学院;2012年

4 关涛;抗叶酸代谢药MTX诱导神经管畸形动物模型及其对基因组稳定性的影响[D];山西医科大学;2011年

5 杨青;高温致金黄地鼠神经管畸形差异表达基因的筛选、鉴定及功能研究[D];山东大学;2007年

6 仇小强;先天性心脏病和神经管畸形分子流行病学研究[D];华中科技大学;2008年

7 高青;妊娠糖尿病致胚胎神经管畸形及其机理的实验研究[D];山东大学;2008年

8 胡淑敏;一氧化氮合酶与神经管畸形关系的研究[D];中国医科大学;2007年

9 雷云平;VANGL基因和DACT1基因与神经管畸形的相关性研究[D];复旦大学;2010年

10 韩仲吉;氧化应激和DNA甲基化在同型半胱氨酸诱导神经管畸形中的作用机制探讨[D];北京协和医学院;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 周长城;叶酸干预对神经管畸形鼠Pax3基因及H3K27me3的作用研究[D];宁夏医科大学;2015年

2 于震;母鼠孕期补充维生素D预防LPS诱发的神经管畸形[D];安徽医科大学;2015年

3 卜兆丽;人类神经管畸形患者携带STIL基因稀有变异E863K和A1047D干扰SHH信号转导进而抑制细胞增殖[D];山西医科大学;2015年

4 张彦;山西省神经管畸形发生的时空分布研究及其环境影响因子探测[D];中国矿业大学;2015年

5 石英飞;肌醇代谢障碍在神经管畸形发生中的作用机制研究[D];北京工业大学;2015年

6 郭倩;低氧诱导因子HIF3α在神经管畸形中的表达及作用分析[D];山西医科大学;2016年

7 李淑静;神经管畸形胎鼠的骶尾部神经管细胞凋亡研究[D];中国医科大学;2010年

8 郭丽;细胞凋亡在神经管畸形发生中作用的初步研究[D];山西医科大学;2010年

9 贾小慧;母体生化代谢和营养状况与胎儿神经管畸形的相关研究[D];山西医科大学;2014年

10 裴利花;同型半胱氨酸及其代谢酶基因多态性与神经管畸形发生的关系[D];中南大学;2011年

本文编号：864167