帕金森病模型大鼠脚桥核与皮层—基底节环路β振荡网络的研究

发布时间：2017-09-19 06:10

  本文关键词：帕金森病模型大鼠脚桥核与皮层—基底节环路β振荡网络的研究

  更多相关文章： 帕金森病 局部场电位 功率谱密度 相干性 格兰杰因果分析

【摘要】：研究背景：帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一种老年人常见的中枢神经系统退行性疾病,其主要病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine, DA)能神经元的变性死亡、纹状体DA含量显著性减少,从而导致肢体震颤、肌肉僵直和运动迟缓等三大运动性症状。PD早期以左旋多巴等药物治疗效果较好,当药物疗效逐渐下降、出现严重副作用以及异动症等并发症时,可考虑手术治疗作为药物治疗的一种有效补充,脑深部电刺激术(deep brain stimulation, DBS)是目前PD外科治疗的首选方案,以丘脑底核(subthalamic nucleus, STN)为刺激靶点的DBS治疗能全面改善PD的三大临床症状,同时也能减少药物用量。然而,当病程进展到中晚期时,半数以上PD患者可出现姿势不稳和步态障碍(Postural instability and Gait disorder, PIGD)的中轴症状(axial symptoms),可表现为频繁跌倒、慌张步态、冻结步态(freezing of gait, FOG)等,并随病程进展,症状逐渐加重。不管是左旋多巴等药物治疗,还是以STN等为刺激靶点的DBS治疗,均不能有效地改善这些严重影响PD患者生活质量的中轴症状,使之成为晚期PD患者临床治疗的一个难题,是导致患者致残的主要原因。近年来,临床研究和非人灵长类动物实验发现脚桥核(pedunculopontine nucleus, PPN)的功能失调可能与晚期PD患者中轴症状的产生具有较为密切的联系,并且研究还发现低频电刺激PPN可有效改善晚期PD的中轴症状,PPN有望成为应用于临床治疗晚期PD姿势和步态障碍的潜在靶点,引起越来越多的学者重视。因此,对PPN的生理功能及其在帕金森病中病理生理改变的研究,将有助于阐明中轴症状的发生机制以及PPN-DBS的作用机制。神经电生理学记录和分析的方法是研究PD的病理生理学改变和DBS具体作用机制的重要方法。近年来,局部场电位(local field potential, LFP)的电生理学记录方法逐渐被研究者们重新重视起来,被越来越多地应用于研究帕金森病及其他运动障碍性疾病的病理生理学机制。局部场电位是一种振荡性的电活动(oscillatory activity),反映局部区域一群神经元以及突触结构等的综合电位变化或同步性电活动结果。与脑电(EEG)类似,可根据振荡的频率分为几个特定频段：δ频段(1-3Hz)、θ频段(4-7Hz)、α频段(8-13Hz)、β频段(14-30Hz)、γ频段(30Hz)。研究者们已经在PD皮层-基底节环路记录到了许多不同频段的振荡电活动,其中最重要的是β频段振荡电活动,目前被大多数研究者认为是帕金森病电生理学方面的一个重要特征,是一种病理性的电活动,具有抵抗运动或抑制运动的效应(anti-kinetic effects),从而导致PD运动迟缓等临床运动症状的产生。近几年,许多研究者对实施了PPN-DBS手术的PD患者进行了电生理记录,利用手术植入PPN的刺激电极记录了PPN的局部场电位,以此来研究PPN中的振荡性电活动,也发现了几种频段的振荡电活动,包括：(1)可能是PPN中一种重要的生理性振荡电活动并在PD中出现病理性减少的α频段振荡电活动；(2)对其性质尚存争议的β频段振荡电活动,多数认为可能和基底节中的β振荡一样,具有anti-kinetic的作用,但也有Tsang等人得到不一致的研究结果,因此对于PPN中的β振荡电活动有待进一步研究。(3)θ频段和γ频段的振荡电活动。θ振荡可能参与了运动时PPN和感觉运动皮层之间的感觉信息的反馈过程,γ振荡可能和β振荡类似,也是一种病理性的电活动,这些均有待进一步的研究。虽然临床研究获得了一些重要的结果,但是这些临床研究只能利用实施过PPN-DBS手术的病人进行研究,而目前接受PPN-DBS手术治疗的病例数量有限,并且缺乏正常状态的数据对比,同时难以和其他核团或脑区联系起来进行更深入的分析,所以需要动物实验进行有效补充和深入研究,促进对PD中轴症状发生机制以及PPN-DBS作用机制的理解。目的：本研究使用Cerebus多通道神经信号记录系统同步记录6-OHDA诱导的PD模型大鼠PPN、初级运动皮层(primary motor cortex, M1)和STN三个部位的局部场电位,并对这些部位的电活动进行功率谱密度、相干性以及格兰杰因果分析,从而实现以下三个研究目的：(1)记录研究PD模型大鼠PPN中的振荡性电活动；(2)研究PPN的振荡性电活动和皮层-基底节环路的振荡性电活动之间的关系；(3)研究左旋多巴药物对PPN和皮层-基底节环路的振荡性电活动的影响。方法：1、实验分组本实验选用健康成年的无特定病原体(Specified pathogen free, SPF)级雄性SD大鼠(Sprague Dawley rat) 30只。随机分为三组：(1)假损毁组(n=10),右侧前脑内侧纵束(medial forebrain bundle, MFB)立体定向注射4μl生理盐水；(2)损毁组(n=13),右侧MFB立体定向注射4μ1 6-OHDA溶液(3μg/μl),损毁黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)多巴胺能神经元；(3)损毁+左旋多巴组(n=7),右侧MFB立体定向注射4μ1 6-OHDA溶液(3μg/μl),并且接受左旋多巴药物治疗。2、实验流程(1)所有大鼠在多通道电极植入手术前适应性饲养一周,并进行转棒行为学训练,转棒转速6圈／分钟,每天训练3次,每次让大鼠静止站立于转棒上5分钟,接着在转棒上行走5分钟；(2)对所有大鼠进行多通道记录电极植入手术,同时损毁组和损毁+左旋多巴组在脑内注射6-OHDA制作PD大鼠模型,假损毁组注射等量生理盐水；(3)术后休息恢复一周后,再次进行转棒行为学训练,操作同前；(4)术后两周进行阿扑吗啡旋转测试,初步评估造模效果；(5)术后三周开始进行电生理记录采集数据；(6)数据收集完毕后,处死大鼠进行组织学检测。3、模型的制作和记录电极的植入所有大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉,固定于立体定向仪。青霉素腹腔注射预防感染。根据Paxinos and Watson的《大鼠脑立体定向图谱》,以前囟为参考点,计算右侧MFB以及右侧M1、STN、PPN的坐标,在颅骨上标记(MFB：前囟后1.8mm,中线旁开2.0mm,深度颅骨下8.3mm；M1：前囟前1.0mm,中线旁开2.3mm,颅骨下2.0mm; STN:前囟后3.5mm,中线旁开2.5mm,颅骨下8.2mm；PPN:前囟后7.8mm,中线旁开2.0mm,颅骨下7.2mm)。高速涡轮牙钻在各标记点钻孔至硬脑膜,MFB处骨窗0.5mm, M1、STN、PPN处骨窗1.0mm,安装6个锚定螺钉,贴至硬脑膜,固定和连接电极地线。用10μl微量注射器在损毁组和损毁+左旋多巴组大鼠右侧MFB注入新鲜配制的含0.02%维生素C的6-OHDA溶液(12μg/4μ1),假损毁组右侧MFB注入4μl含0.02%维生素C的生理盐水。显微镜下去除M1、STN、PPN骨窗内的硬脑膜,依次在三个部位植入8导不锈钢微丝电极。吸干颅骨表面液体,牙托水泥固定电极丝,覆盖全部颅骨并制作成电极连接的平台。4、神经电信号数据采集所有大鼠在手术后三周开始进行M1、STN、PPN的局部场电位数据的采集,分别记录大鼠在转棒仪上静止和行走两种行为状态下的电活动。微电极阵列的接口与headstages连接,使大鼠平稳站立在转棒上,适应片刻后保持静止,记录5分钟静止状态下的局部场电位,接着调节转棒仪转速至6圈/分钟,再记录5分钟行走状态下的局部场电位。每只大鼠一共记录6次5分钟静止和5分钟行走状态下的局部场电位。记录电活动的同时使用摄像头录像监测和记录大鼠的行为,以备后续分析。采集局部场电位时,以地线作参考,采样率10 KHz,放大倍数300×,带通滤波0.3-500 Hz。所有大鼠记录6次完毕后,损毁+左旋多巴组大鼠给予腹腔注射左旋多巴(5 mg/Kg)和苄丝肼(15mg/Kg),给药20分钟后开始记录局部场电位,操作同上,每只大鼠记录6次给药后5分钟静止和5分钟行走状态下的局部场电位。5、组织学所有大鼠记录完毕后腹腔麻醉,电极连接电毁损仪通以阳极直流电,使电极尖端涌出铁离子,与亚铁氰化钾生成蓝色络合物定位电极尖端。开胸心脏灌注生理盐水,直至肝脏颜色变白,换成含5%亚铁氰化钾的4%多聚甲醛溶液,量约400m1/只。断头取脑多聚甲醛外固定24小时,25%和30%蔗糖脱水,包埋剂包埋-80℃冰箱快速冷冻。切片时,先冠状位修整脑组织平面,参照Paxinos and Watson的《大鼠脑立体定向图谱》确定M1、STN、SNc、PPN的位置,在接近各确定部位时作连续冠状切片,每隔3张切片保留2张,M1、STN、PPN三个部位片厚40pm, SNc处片厚25pm。 SNc处的切片进行TH免疫组化染色确定多巴胺能神经元损毁情况,M1、STN、PPN的切片进行尼氏染色确定电极尖端的位置。6、局部场电位数据分析本实验对局部场电位的分析包括三个方面：功率谱密度(Power spectral density)。相干性(Coherence)。格兰杰因果分析(Granger causality analysis) 。分析之前需要对数据进行初步筛选,根据组织切片染色结果,剔除电极尖端不在目标脑区或核团所属范围的大鼠。每只大鼠每个脑区或核团选取1-2根微电极丝所采集的噪音较少的数据,每种行为状态(静止或行走)选取120秒无明显噪音、伪迹的时间段进行计算。(1)功率谱密度功率谱密度是从频域的角度,对信号及其强度进行解析的一种分析方法。本实验使用MATLAB工具包Chronux对局部场电位进行功率谱密度的计算,Chronux采用的是一种多抽头的谱估计方法(multi-taper spectral estimation)。先对局部场电位的数据降低采样率,重新采样到1000Hz,将120秒数据均匀分割成120小段,每段1秒作为一个计算单位,对数据进行去除慢漂和50Hz工频干扰的处理后,进行计算并将所得结果进行平均。计算时Chronux中的重要参数设置如下：params.fpass= [0 100](所计算的频段范围是0-100Hz)；params.tapers = [3 5](为达到最好的平滑度time-bandwidth设置为3,tapers设置为5)；频率分辨率为1Hz。每只大鼠分别计算静止和行走两种行为状态下M1、STN、PPN三个部位记录的局部场电位的功率谱密度。(2)相干性相干性分析是常被用于评估不同脑区之间功能关系的一种分析方法,是对两个信号之间线性相关关系的一种标准估量。相干性的取值为从0到1,0代表两个信号无线性相关；1代表两个信号具有极好的线性相关。如果不同脑区的信号具有较强的相干性,则说明脑区之间存在着一定的功能联系。继续使用MATLAB工具包Chronux进行相干性的计算。同样对局部场电位的数据降低采样率,重新采样到1000Hz,将120秒数据均匀分割成120小段,每段1秒作为一个计算单位,对数据进行去除陧漂和50Hz工频干扰的处理后,进行计算并将所得结果进行平均。计算时Chronux中的重要参数设置如下:params.fpass = [0100](所计算的频段范围是0-100Hz)；params.tapers = [7 13](为达到最好的平滑度将time-bandwidth设置为7,tapers设置为13)；频率分辨率为1Hz。每只大鼠分别计算两种行为状态下(静止和行走)M1、STN、PPN三个部位记录的局部场电位两两之间的相干性(即cohM1-STN、cohM1-PPN、cohSTN-PPN)。(3)格兰杰因果分析通过计算相干性可以得知不同脑区之间是否存在功能联系,但不同脑区之间的信息是如何流动的仍然无法判定,因此需要进一步进行因果分析。本实验通过计算频域上的偏相关格兰杰因果系数(partial Granger causality in the frequency domain)进一步分析M1、STN、PPN三个部位记录的局部场电位之间的因果联系。格兰杰因果分析是常被用于判断一个时间序列是否能预测另一个时间序列的一种分析方法。如果一个观测到的时间序列x(n)过去的信息能够显著提高对另一个时间序列y(n)的预测性,则可以说信号x(n) Granger-causes信号y(n),,即两个信号之间存在因果关系,信号x(n)是因,信号y(n)是果。如果需要分析的信号或者记录的部位多于两个时,则需要使用偏相关格兰杰因果分析。在分析其中某两个信号的因果关系时,需要把其他信号的影响也考虑进来。本实验使用MATLAB软件采用多变量自回归模型(multivariate autoregressive modeling)的方法来计算partial Granger causality。主要步骤为：第一步是model order的估计,最佳model order通过Akaike Information Criterion(AIC)选出；第二步是Vector AutoRegressive (VAR) model的估计,使用第一步得到的model order通过the Levinson, Wiggins and Robinson (LWR) algorithm计算获得VAR model;第三步通过第二步的VAR model计算得到autocovariance sequence;最后通过autocovariance sequence计算获得partial Granger causality 。7、统计学采用SPSS20.0、MATLAB和GraphadPad prism 5.0进行数据统计分析和作图。假损毁组和损毁组大鼠功率谱密度的差异以及相干性的差异需要在0-100Hz上逐个频率点进行比较,为解决多重比较问题,本实验采用cluster-based, nonparametric permutation t-tests (n = 1,000 permutations, corrected for multiple comparisons)的方法进行统计检验,每个频率点的数据采用均数±标准误表示。β频段的功率谱、相干性和格兰杰因果系数在假损毁组、损毁组和损毁+左旋多巴组之间的比较均采用Kruskal-Wallis test及Dunn's Multiple Comparison Test post hoc的统计检验方法。以P0.05为差异有统计学意义。结果：1、损毁黑质纹状体多巴胺神经元后功率谱密度的变化在大鼠行走运动时,损毁组大鼠三个部位的β频段功率均较假损毁组显著增高,但各自增高的频段范围不完全一致,M1为15-24 Hz (P=0.042), STN为13-28 Hz(P=0.014),PPN为14-22 Hz(P=0.035)。在大鼠静止时,损毁组大鼠M1的β频段功率较假损毁组显著增高,频率范围为21-35 Hz(P=0.042),而静止时两组大鼠STN、PPN的功率谱密度在0-100Hz上均未见显著差异(P0.05)。2、损毁黑质纹状体多巴胺神经元后对相干性的影响在大鼠行走运动时,损毁组大鼠三个部位两两之间β频段的相干性均较假损毁组显著增高,M1-STN为10-34 Hz (P = 0.004), M1-PPN为11-36 Hz (P = 0.006), STN-PPN为14-28 Hz(P=0.01)。在大鼠静止时,两组大鼠三个部位各自之间的相干性在0-100Hz上均未见显著差异(P0.05)。3、多巴胺能药物治疗对p频段功率谱密度和相干性的影响帕金森病模型大鼠在接受左旋多巴治疗后,原本在β频段增加的功率谱密度和相干性均降低到正常水平(P0.05)。4、p振荡电活动格兰杰因果分析结果格兰杰因果分析结果显示,在STN→M1(P 0.001)、STN→PPN(P 0.001)和PPN→M1(P 0.001)三个方向上,6-OHDA损毁组的p频段格兰杰因果系数显著高于假损毁组和损毁+左旋多巴组；而在各自的反方向上(M1→STN、 PPN→STN、M1→PPN),三组的p频段格兰杰因果系数没有显著差异(P0.05)。这说明p振荡电活动在Ml、STN、PPN三个部位之间的流动方向是STN →M1→STN→PPN和PPN→M1;并且多巴胺能药物(左旋多巴)治疗后,STN→M1→STN→PPN和PPN→M1三个方向上的p频段格兰杰因果系数降低到正常水平。结论：1、本实验在帕金森病模型大鼠行走时记录到了在M1、STN和PPN三个部位增强的p频段振荡电活动,是首次在6-OHDA帕金森病模型大鼠PPN记录到增强的p振荡电活动的研究。且PPN中记录到的p振荡电活动很有可能来自于基底节中的STN。2、根据格兰杰因果分析,增强的p振荡电活动在M1、STN、PPN三个部位之间的流动方向是STN→M1、STN→PPN和PPN→M1。其中,STN在这个p振荡的网络中起着主导性作用,STN可能是帕金森病中异常p振荡电活动的源头。3、虽然左旋多巴药物能抑制PPN增强的β振荡电活动,却不能缓解帕金森病患者步态和姿势障碍的中轴症状,因此,β振荡电活动可能并不是导致帕金森病人中轴症状的主要病理生理电活动基础。
【关键词】：帕金森病 局部场电位 功率谱密度 相干性 格兰杰因果分析
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.5;R-332
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-22
• 第一章 前言22-29
• 第二章 材料与方法29-42
• 2.1 实验材料29-33
• 2.2 实验方法33-42
• 第三章 结果42-54
• 3.1 大鼠的剔除情况42
• 3.2 免疫组织化学染色结果42-43
• 3.3 尼氏染色结果43-44
• 3.4 局部场电位数据分析结果44-54
• 第四章 讨论54-59
• 4.1 PPN中β频段振荡电活动的分析54-55
• 4.2 β频段振荡电活动环路及来源的分析55-57
• 4.3 多巴胺能药物对β频段振荡电活动影响的分析57-59
• 第五章 结论59-60
• 参考文献60-65
• 综述65-81
• References75-81
• 中英文缩略词对照表81-82
• 攻读学位期间成果82-83
• 致谢83-85

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