肝豆汤对Wilson病脾脏免疫功能的影响及调节作用机制的相关研究

发布时间：2017-09-26 22:22

  本文关键词：肝豆汤对Wilson病脾脏免疫功能的影响及调节作用机制的相关研究

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【摘要】：研究背景Wilson病是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍性疾病。目前WD合并脾功能亢进的患者不在少数,这类患者体内存在着免疫功能的紊乱,且推测可能与脾脏免疫功能状态的改变有着密切的联系。但其内在机制尚不清楚,目前鲜有相关的文献报道。作为少数可治的神经遗传病之一,Wilson病目前以运用铜离子螯合剂行驱铜治疗为主,但缺点是不良反应多。肝豆汤作为一种中药配方治疗Wilson病在临床上被证明是有效的,具有不良反应少,作用持久、和缓的特点。杨任民等Wilson病中西医结合基础与临床研究团队根据中医辨证论治理论和多年的临床经验总结,将肝豆汤原方制成肝豆片应用于Wilson病的临床治疗,在驱铜效果和临床症状的改善方面均取得了较为满意的疗效。目前针对肝豆汤药理机制尚处于研究阶段,有必要对其是否能够通过调节Wilson病脾脏免疫功能产生治疗作用开展相关研究。TX小鼠的遗传背景、铜生化特征以及病理特点与Wilson病类似,因此可作为Wilson病研究较理想的动物模型。研究表明,Wilson病的免疫功能紊乱与多种因素有关,如肝脏损害处理抗原能力的减弱、肠源性内毒素血症、细胞因子的紊乱、门静脉高压合并脾功能亢进、微量元素代谢及生物转化障碍等;脾脏是人类和其它哺乳动物(如小鼠)的细胞免疫和体液免疫的中心。它参与T淋巴细胞的免疫调节,调节外周血T细胞的数量与分布;参与介导B淋巴细胞抗原提呈反应;参与制造免疫球蛋白、补体等免疫物质,促进吞噬作用,清除体内外抗原;同时脾血窦还具有贮存血液、必要时补充血容量,以及吞噬衰老的红细胞、病原体和异物的功能。脾脏免疫功能的紊乱是多种疾病发生及进展的主要原因,它是否也与Wilson病免疫功能异常有重要的关联,目前未见相关报道。第一部分:杨任民等Wilson病中西医结合基础与临床研究团队应用肝豆汤(片)治疗Wilson病的理论依据及临床经验总结1.总结杨任民等Wilson病中西医结合基础与临床研究团队对于Wilson病中医辨证论治的基本观点和方法;2.对于杨任民等Wilson病中西医结合基础与临床研究团队应用肝豆汤(片)治疗Wilson病的临床经验和相关研究成果进行总结;3.肝豆汤对于Wilson病患者免疫相关指标的改善及治疗方面研究总结第二部分:肝豆汤对Wilson病脾脏细胞免疫功能影响的实验研究目的:了解Wilson病模型TX小鼠脾脏病理、细胞免疫指标的表达、微量元素代谢状况,以及肝豆汤对TX小鼠脾脏的细胞免疫相关指标影响与改善,并结合相关文献对TX小鼠脾脏细胞免疫状态及肝豆汤治疗作用的相关机制进行探讨。方法:1.肝豆汤治疗组:随机选取2月龄TX小鼠40只归为肝豆汤治疗组,该组每日分两次予中药0.2ml/10g/次灌胃给药,连续30天;模型组:随机选取2月龄TX小鼠40只归为TX模型组,每日分两次予生理盐水各0.2ml/10g/次灌胃,连续30天。正常对照组:随机选取正常2月龄DL小鼠40只,进行正常饲养,连续30天。三组在30天后每组随机选取20只小鼠行颈椎脱臼法处死,留取脾脏标本。2.通过对脾组织冰冻切片行HE染色,观察Wilson病模型TX小鼠脾组织病理形态的改变。3.应用流式细胞术检测小鼠脾组织T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+,Western-Blot检测白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的表达,了解肝豆汤对于Wilson病模型TX小鼠脾脏细胞免疫状态的影响与改善。4.通过等离子体原子发射光谱法检测各组Wilson病模型TX小鼠脾组织中铜、锌、铁微量元素的含量,了解肝豆汤对于Wilson病模型TX小鼠脾脏微量元素代谢的影响。结果:1.TX小鼠脾组织病理形态特点及变化肝豆汤组TX小鼠脾脏HE染色切片可见白髓与红髓分界较为清晰,白髓数量较正常对照组无明显增加或减少,白髓中大量淋巴细胞聚集;红髓区域脾索较对照组细,数量减少,脾血窦与切片裂隙无法区分;脾小梁形态结构欠完整。400倍视野可见白髓边缘有核深染细胞,巨噬细胞数量似有增多,个别形态异常的巨噬细胞出现。模型组TX小鼠脾脏HE染色切片可见白髓与红髓分界尚清晰,个别白髓形态被裂纹破坏,白髓中有大量淋巴细胞聚集;红髓区域脾索数量较前两组少、形态偏细,脾血窦数量增多、明显扩大;未发现完整脾小梁结构。镜下400倍视野可见白髓周围核深染细胞,巨噬细胞数量似有增多。2.流式细胞术检测经肝豆汤治疗TX小鼠脾组织内CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的表达三组小鼠表达于脾组织内的T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+及CD4+/CD8+均存在显著统计学意义(p值分别为0、0、0.016,p0.01)。脾组织内CD4+、CD8+的表达均是模型组TX小鼠最高,正常对照组DL小鼠最低,差异有统计学意义;而肝豆汤组及模型组TX小鼠脾脏CD4+/CD8+明显低于正常对照组DL小鼠,差异有统计学意义;肝豆汤组CD4+/CD8+与模型组相比稍高,但差异无统计学意义。3.Western-Blot法检测经肝豆汤治疗TX小鼠脾组织内IL-8、IL-18的蛋白定量表达三组间IL-18在脾组织内的相对表达量有差异,具有统计学意义(p值为0.045,p0.05);其中模型组脾组织IL-18相对表达量高于正常对照组,差异有统计学意义;而模型组与肝豆汤组、肝豆汤组与正常对照脾组织IL-18相对表达差异均无统计学意义。三组间IL-8在脾组织内的相对表达量有显著差异,具有统计学意义(p值为0,p0.01);其中模型组TX小鼠脾组织IL-8的相对表达量明显高于其他两组(p值分别为0、0,p0.01),具有极显著统计学意义,;肝豆汤组TX小鼠脾组织IL-8的相对表达量高于正常对照组DL小鼠,差异有统计学意义(p值为0.04,p0.05)。4.经肝豆汤治疗TX小鼠脾脏微量元素的变化三组脾Zn含量差异无统计学意义(F值为0.24,p值为0.787,p0.05)。三组脾Cu含量比较有极显著统计学意义(H值为15.53,p值为0,p0.01);其中模型组TX小鼠脾Cu含量明显高于其他两组,差异有统计学意义(p值分别为0.02、0,p0.05);肝豆汤组TX小鼠脾Cu含量略高于正常对照组DL小鼠,但无统计学意义(p值为0.6,p0.05)。三组脾Fe含量比较有差异,具有统计学意义(H值为7.088,p值为0.029,p0.05);模型组TX小鼠脾Fe高于正常对照组,差异有统计学意义(p值为0.04,p0.05);肝豆汤组TX小鼠脾Fe与其他两组比较均无统计学意义(p值分别为0.89、0.13,p0.05)。结论:1.WD模型TX小鼠脾脏存在红髓结构的异常,包括脾索变细、数量减少,脾血窦扩张;巨噬细胞数量增多、个别形态异常;个别的细胞胞核深染等病理改变。肝豆汤中短期治疗对TX小鼠脾脏形态改变不明显。2.TX小鼠脾脏内T淋巴细胞功能活跃,存在细胞免疫功能的亢进,但仍以负向免疫调节为主。肝豆汤对TX小鼠细胞免疫亢进状态具有改善调节作用,但仅依靠肝豆汤难以扭转TX小鼠机体负向免疫调控的状态。3.TX小鼠脾脏细胞因子IL-8、IL-18的高表达进一步证明其存在细胞免疫亢进的免疫紊乱状态,可能与TX小鼠因铜沉积引起的组织损伤、肝纤维化的免疫相关损伤机制有关联。同时,其IL-18的高表达也可能是TX小鼠机体免疫紊乱的一种代偿机制或负反馈机制,须进一步研究加以证实。肝豆汤具有调节TX小鼠细胞因子相关免疫紊乱的作用,但在中短期疗程对TX小鼠IL-8、IL-18调节能力有限。4.TX小鼠脾脏也是铜代谢异常所致铜沉积的靶器官之一;TX小鼠存在脾组织微量元素Cu、Zn的代谢异常,但是否存在脾Fe的代谢异常尚缺乏实验证据。试验证明肝豆汤对TX小鼠确有较为明显的驱铜治疗作用;而肝豆汤在排铜的同时也可能存在排锌的作用;肝豆汤对TX小鼠脾Zn及脾Fe的代谢影响不显著。
【关键词】：肝豆汤 TX小鼠 脾脏 细胞免疫功能
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 中文摘要6-10
• Abstract10-17
• 英文缩略词表17-18
• 前言18-20
• 第一部分：杨任民等Wilson病中西医结合基础与临床研究团队应用肝豆汤（片）治疗Wilson病的理论依据及临床经验总结20-31
• 1 杨任民等Wilson病中西医结合基础与临床研究团队对Wilson病的中医辨证论治20-21
• 2 杨任民等Wilson病中西医结合基础与临床研究团队临床应用肝豆汤治疗WD的疗效经验总结21-26
• 2.1 肝豆汤在中西医结合治疗方案中的应用和临床疗效研究21-22
• 2.2 杨任民等Wilson病中西医结合基础与临床研究团队临床应用肝豆汤的经验汇总及分析22-26
• 3 肝豆汤改善Wilson病患者免疫相关指标的研究总结26-31
• 3.1 Wilson病免疫功能紊乱相关机制的研究26-28
• 3.2 肝豆汤临床应用改善WD患者免疫指标的研究经验1128-31
• 第二部分：肝豆汤对Wilson病脾脏免疫功能影响的实验研究.1431-57
• 1 资料与方法31-42
• 1.1 实验材料31-36
• 1.2 实验技术路线与方法36-42
• 1.3 数据统计及处理42
• 2 实验结果42-48
• 2.1 TX小鼠脾组织病理形态特点及变化42-44
• 2.2 流式细胞术检测经肝豆汤治疗TX小鼠脾组织内CD~（4+）、CD~（8+）及CD~（4+）/ CD~（8+）的表达44-45
• 2.3 Western-Blot法检测经肝豆汤治疗TX小鼠脾组织内IL-8、IL-18 的蛋白定量表达45-47
• 2.4 经肝豆汤治疗TX小鼠脾脏微量元素的变化47-48
• 3 讨论48-57
• 3.1 WD模型TX小鼠建立依据48-49
• 3.2 TX小鼠脾脏形态学变化及其机制49-51
• 3.3 肝豆汤对TX小鼠脾脏免疫功能的影响及调节机制51-54
• 3.4 肝豆汤对TX小鼠脾脏微量元素的影响54-57
• 结论57-58
• 参考文献58-68
• 综述68-76
• 参考文献73-76
• 致谢76-77
• 个人简介77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：926045