胶质瘤中S100A4的表达和其在胶质瘤细胞侵袭迁移中作用的研究

发布时间：2017-09-27 15:09

  本文关键词：胶质瘤中S100A4的表达和其在胶质瘤细胞侵袭迁移中作用的研究

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【摘要】：恶性胶质瘤是最常见的原发性神经系统肿瘤,现阶段的临床治疗原则是以手术为主、辅以放射和化学药物治疗的综合治疗。单凭现有的临床方案,虽然在一定程度上提高了患者的生存质量及或延长了生存期,但尚不能治愈。由于恶性胶质瘤侵袭、播散性的生长方式,患者即使接受了规范化治疗,中位生存期也仅为14个月。而针对肿瘤恶性进展的分子靶向治疗为胶质瘤的治愈提供了可能。近些年来,研究主要集中在胶质瘤分子生物学的机制上,力图寻找新的分子靶点,并通过抑制这些靶点对胶质瘤的生长、增殖、迁移和侵袭起到抑制作用。S100A4是S100蛋白超家族成员之一,是一种低分子量(10-12KDa)、钙离子依赖性的蛋白,以同源或异源二聚体的形式存在于细胞的胞质、胞核或胞质胞核共存。S100A4蛋白与其他家族成员一样,不具有酶促的活性,而是通过调控其他蛋白的表达和直接与靶蛋白结合两种方式发挥作用。相关研究表明,S100A4具有广泛的生物学功能,与许多恶性肿瘤的发生、发展有着密切联系,提示S100A4可能成为治疗恶性胶质瘤分子生物学靶点的其中一员。恶性胶质瘤细胞在脑组织中的迁移运动大体可分为四个步骤:①胶质瘤细胞脱离原发的肿瘤团块;②胶质瘤细胞粘附于细胞外基质;③胶质瘤细胞降解细胞外基质;④胶质瘤细胞改变自身形状,细胞体向前运动。抑制胶质瘤向周围正常脑组织浸润或者复发,控制胶质瘤细胞这种迁移运动是有效方法之一。本课题在胶质瘤组织和细胞系中检测S100A4的表达,并通过体外实验在高表达S100A4的胶质瘤细胞系中探究其在上述细胞迁移运动四个步骤中的作用及其机制。课题研究分为以下两个部分:1、检测S100A4在胶质瘤组织及细胞系中的表达。首先对本院手术留取的43例不同级别的胶质瘤组织标本及11例对照脑组织标本进行免疫组织化学染色,检测不同标本中S100A4的表达含量;然后采用Real-time PCR、Western blot方法分别检测了胃黏膜上皮细胞系GES-1和四个恶性胶质瘤细胞系中S100A4mRNA和蛋白的表达量。结果显示,S100A4在对照脑组织中呈阴性或弱阳性表达,在胶质瘤组织中呈阳性表达,阳性结果表现为胞核阳性、胞质阳性或者核质阳性,并且随着肿瘤级别的增高阳性率也增高;以胃黏膜上皮细胞系GES-1为对照,S100A4 mRNA和蛋白在U87、LN229、U251和SNB19这4个胶质瘤细胞系中均显著高表达,PCR和Western blot的检测结果一致。2、体外实验研究S100A4在胶质瘤细胞迁移和侵袭中的作用。在SNB19和U251两种细胞系中,用S100A4特异性的siRNA进行处理,并且相应的分成control组、siRNA-NC组和siRNA-S100A4组。在不同的处理组中,PCR和Western blot检测S100A4 mRNA和蛋白的表达情况,划痕实验检测胶质瘤细胞的迁移能力,Transwell实验检测胶质瘤细胞侵袭的能力,Western blot技术检测胶质瘤细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimintin、MMP-9和MMP-2的表达量,免疫荧光技术检测S100A4的表达情况与细胞片状伪足、细胞黏着斑的形成情况。免疫共沉淀技术和免疫荧光技术分别检测S100A4蛋白与非肌细胞肌球蛋白IIA亚型(NM IIA)的结合情况。结果显示:S100A4特异性的si RNA可以有效的敲低胶质瘤细胞中S100A4的表达,进而抑制细胞迁移和侵袭的能力;与control组和siRNA-NC组相比,siRNA-S100A4组胶质瘤细胞E-cadherin的表达明显上调,N-cadherin、Vimintin、MMP-9和MMP-2的表达明显降低。在胶质瘤细胞中,S100A4蛋白能与NM IIA相结合,并主要定位于细胞的前端片状伪足处;siRNA-S100A4组细胞的片状伪足明显变小或者不在向前伸出,黏着斑变大、荧光强度变强。结论:1、与对照脑组织相比,胶质瘤组织中S100A4呈高表达,并且高级别胶质瘤组织中S100A4的表达量明显高于低级别胶质瘤组织中的表达量。2、在恶性胶质瘤细胞系中,S100A4的表达含量增高,并且敲低S100A4的表达可抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭的能力。3、S100A4在胶质瘤细胞发生迁移和侵袭的全过程中发挥作用。4、S100A4可能成为抗胶质瘤侵袭迁移治疗的有效靶点。
【关键词】：胶质瘤 S100A4 侵袭 迁移 NMIIA
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 缩略语/符号说明9-12
• 前言12-14
• 研究成果、现状12-13
• 研究目的、方法13-14
• 一、S100A4在胶质瘤组织及胶质瘤细胞系中的表达14-26
• 1.1 对象和方法14-22
• 1.1.1 病历资料和实验对象14
• 1.1.2 实验试剂与仪器14-16
• 1.1.3 实验方法16-21
• 1.1.4 统计学方法21-22
• 1.2 结果22-24
• 1.2.1 免疫组化结果22-23
• 1.2.2 PCR检测细胞系中S100A4 mRNA的表达23
• 1.2.3 Western blot检测细胞系中S100A4蛋白的表达23-24
• 1.3 讨论24-25
• 1.4 小结25-26
• 二、探究S100A4在胶质瘤细胞迁移和侵袭中的作用26-48
• 2.1 对象和方法26-33
• 2.1.1 实验对象、材料和主要仪器26-27
• 2.1.2 实验方法27-32
• 2.1.3 统计学方法32-33
• 2.2 结果33-43
• 2.2.1 细胞生长情况33
• 2.2.2 RT-PCR和Western blot筛选出效果最佳的S100A4 siRNA序列33-35
• 2.2.3 PCR和Western blot分别检测不同处理组中S100A4 mRNA和蛋白的表达情况35-36
• 2.2.4 敲低S100A4的表达对细胞迁移能力的影响36-37
• 2.2.5 敲低S100A4的表达对细胞侵袭能力的影响37-38
• 2.2.6 Western blot检测相关蛋白的表达情况38-39
• 2.2.7 免疫荧光检测S100A4与细胞伪足形成的关系39-40
• 2.2.8 免疫荧光检测S100A4与细胞黏着斑形成的关系40-42
• 2.2.9 免疫共沉淀和免疫荧光检测胶质瘤细胞内S100A4与NM IIA结合及定位42-43
• 2.3 讨论43-46
• 2.4 小结46-48
• 结论48-49
• 参考文献49-55
• 发表论文和参加科研情况说明55-57
• 综述 胶质母细胞瘤侵袭性机制的相关研究进展57-67
• 综述参考文献62-67
• 致谢67

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