人参皂苷Rd对成年大鼠脑内神经干细胞神经发生的影响及机制研究

发布时间：2017-09-30 00:18

  本文关键词：人参皂苷Rd对成年大鼠脑内神经干细胞神经发生的影响及机制研究

  更多相关文章： 人参皂苷Rd 神经干细胞 增殖 分化 PI3K/Akt MAPK/ERK1/2

【摘要】：长期以来,神经病学领域都认为中枢神经系统成熟的神经元属于终末分化细胞,很难再进行分裂和增殖。因而中枢神经系统的损伤、变性导致的神经元丢失及神经元的损伤难以得到自我修复,神经功能的重建被视为不可能。科学家们对体外神经干细胞(NSCs)分离培养和增殖的成功,为中枢神经系统的再生和功能重建带来了新的希望。但目前已有的促进NSCs增殖和分化的方法都因其临床治疗可操作性不强而制约了临床转化应用。因此找到一种促进NSCs增殖和定向分化的药物可能为神经系统疾病的临床治疗提供新的可行途径。人参皂苷Rd(GSRd)是从人参和三七中提取的一种单体化合物,是它们主要活性成分之一。我们前期的临床和基础研究发现,GSRd具有明确的神经保护作用:治疗脑梗死安全有效、减少脑缺血模型大鼠梗死体积、减少神经元死亡、促进大鼠运动功能恢复等。但GSRd是否能促进成年哺乳动物脑内NSCs的神经发生从而发挥神经修复功能呢?目前还鲜有报道。为此本研究拟在在体和离体探究GSRd对NSCs增殖及分化的作用并初步探索可能的分子机制。第一部分GSRd对成年大鼠脑内海马齿状回神经发生影响的研究目的:探究GSRd对海马齿状回NSCs增殖分化的影响。方法:(1)30 mg/kg的GSRd腹腔注射到成年大鼠体内,每天注射1次,连续注射1周。GSRd给药后的第7 d和第14 d处死大鼠,将海马区切片,通过Brd U染色、DCX染色,观察GSRd对海马区NSCs增殖和新生神经元的影响。(2)GSRd给药后的第34 d处死大鼠,将海马区切片,进行Brd U/Neu N和Brd U/GFAP荧光双标记染色,观察GSRd对海马区NSCs分化的影响。结果:(1)GSRd干预后7 d,GSRd组的海马齿状回Brd U和DCX阳性细胞数明显增加(P0.05);GSRd干预后14 d,GSRd组海马区Brd U和DCX阳性细胞的数目与对照组相比无明显差异。(2)GSRd组的Brd U+/Neu N+双标记细胞与对照组相比,数量明显增加(P0.05)。但两组Brd U+/Neu N+双标记细胞占总Brd U+细胞百分数无统计学差异。另外,对GSRd组和对照组进行Brd U/GFAP免疫荧光双标记染色,两组均没有观察到Brd U+/GFAP+双标记细胞。结论:GSRd显著增加海马齿状回NSCs及新生神经元的数量,但对NSCs的分化并无明显作用。第二部分GSRd对培养NSCs增殖分化影响的研究目的:探究GSRd对体外培养NSCs增殖分化的影响。方法:(1)分离培养胎鼠NSCs并进行神经球鉴定和分化鉴定。(2)体外培养NSCs,经过不同浓度GSRd干预后,观察神经球的数量和大小的变化;CCK-8法、Brd U免疫荧光染色分别观察GSRd对NSCs存活和增殖的影响。(3)体外培养NSCs,经过GSRd干预后,分别进行Tuj-1、GFAP和CNPase免疫荧光染色,观察GSRd对NSCs分化的影响。结果:(1)对体外培养的NSCs进行Nestin、Ki67免疫细胞化学染色,结果显示被染色的细胞呈Nestin阳性和Ki67阳性反应。Tuj-1、GFAP、CNPase免疫细胞化学染色结果显示,所培养的NSCs可以定向分化为神经元、星形胶质细胞以及少突胶质细胞,具有多向分化的潜能。(2)与对照组相比,GSRd组神经球的数目和直径明显增加(P0.05);CCK-8法、Brd U免疫荧光染色结果显示,GSRd可明显促进体外培养的NSCs的存活和增殖(P0.05)。(3)体外培养的NSCs,GSRd处理组Tuj-1、GFAP和CNPase阳性细胞百分率与对照组相比无明显差异。结论:GSRd可促进体外培养NSCs存活和增殖,对体外培养NSCs的分化无影响。第三部分GSRd促进神经干细胞神经发生机制的研究目的:探究GSRd促进神经干细胞神经发生可能的分子机制。方法:(1)Western Blot测定GSRd干预后的NSCs中Akt、p-Akt、ERK、p-ERK、PKC、p-PKC蛋白表达水平;(2)Western Blot测定PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002、MAPK/ERK1/2信号通路抑制剂PD98059干预下经GSRd作用的NSCs中Akt、p-Akt、ERK、p-ERK蛋白表达;(3)CCK-8法、Brd U免疫荧光染色分别观察LY294002和PD98059干预下经GSRd作用的NSCs的存活和增殖。结果:(1)与对照组相比,GSRd组p-Akt、p-ERK蛋白表达明显增加(P0.05),但Akt、ERK、PKC、p-PKC蛋白表达与对照组相比无明显差异。(2)与GSRd组相比,LY294002干预组和PD98059干预组p-Akt、p-ERK蛋白表达降低(P0.05)。(3)LY294002和PD98059可明显减弱GSRd干预的NSCs的存活和增殖(P0.05)。结论:GSRd可能通过PI3K/Akt和MAPK/ERK1/2信号通路调控NSCs的神经发生。
【关键词】：人参皂苷Rd 神经干细胞 增殖 分化 PI3K/Akt MAPK/ERK1/2
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R741
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-15
• 文献回顾15-25
• 第一部分 NSCS在治疗神经退行性疾病方面的潜能15-21
• 1 NSCs的性能和特点15-17
• 1.1 增殖和自我更新15-16
• 1.2 多潜能性16-17
• 1.3 分子标记17
• 2 神经发生及其潜能17-18
• 3 NSCs治疗衰老相关神经退行性疾病的潜能18-20
• 4 基于NSCs疗法的前景20-21
• 第二部分 GSRD在神经系统中的作用21-25
• 1 GSRd具有明确的神经保护作用21-22
• 2 GSRd对退行性疾病的神经保护作用22-25
• 第一部分 GSRD对成年大鼠脑内海马齿状回神经发生影响的研究25-34
• 1 材料25-26
• 1.1 实验动物以及分组25-26
• 1.2 实验试剂和配制方法26
• 1.3 主要仪器及耗材26
• 2 方法26-28
• 2.1 BrdU给药26-27
• 2.2 组织准备27
• 2.3 免疫组织染色27-28
• 2.4 统计学分析28
• 3 结果28-32
• 3.1 GSRd促进海马区NSC的增殖28-31
• 3.2 BrdU/NeuN和BrdU/GFAP双标记染色结果31-32
• 4 讨论32-34
• 第二部分 GSRD对体外培养NSCS增殖分化的影响的研究34-52
• 1 材料34-37
• 1.1 实验动物34
• 1.2 主要试剂和配制方法34-36
• 1.3 主要仪器及耗材36-37
• 2 方法37-42
• 2.1 分离、培养NSCs37-38
• 2.2 体外培养NSCs鉴定38-39
• 2.3 NSCs的冻存和复苏39-40
• 2.4 神经球计数40
• 2.5 CCK-8 检测40-41
• 2.6 免疫细胞化学染色41-42
• 3 结果42-50
• 3.1 大鼠NSCs的分离培养42
• 3.2 原代NSCs的形态观察42-43
• 3.3 传代NSCs的形态观察43-44
• 3.4 NSCs鉴定和分化鉴定44-45
• 3.5 复苏后的NSCs形态观察45
• 3.6 不同浓度的GSRd干预体外培养神经球45-46
• 3.7 不同浓度的GSRd干预体外培养的NSCs，，对其存活的影响46-47
• 3.8 GSRd对体外培养NSCs增殖的影响47-49
• 3.9 GSRd干预NSCs，对其分化的影响49-50
• 4 讨论50-52
• 第三部分 GSRD促进神经干细胞神经发生机制的研究52-61
• 1 材料52-53
• 1.1 主要试剂和配制方法52-53
• 1.2 主要仪器及耗材53
• 2 方法53-57
• 2.1 Western Blot法53-56
• 2.2 CCK-8 检测56
• 2.3 BrdU免疫细胞化学染色56
• 2.4 统计学分析56-57
• 3 结果57-60
• 3.1 GSRd激活PI3K/Akt、MAPK/ERK1/2 信号通路57
• 3.2 LY294002、PD98059可逆转p-Akt、p-ERK蛋白表达水平57
• 3.3 LY294002、PD98059减弱了GSRd对NSCs促增殖作用57-60
• 4 讨论60-61
• 小结61-62
• 参考文献62-73
• 附录73-74
• 个人简历和研究成果74-75
• 致谢75

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 杨树源,安沂华;再述神经干细胞的研究及其应用前景[J];中华神经外科杂志;2002年05期

2 黄镇,金国华,徐慧君;神经干细胞研究进展[J];解剖科学进展;2002年01期

3 朱晓峰;神经干细胞研究的几个问题[J];黑龙江医药科学;2002年05期

4 张敬军,夏作理,刘焯霖;神经干细胞的研究[J];泰山医学院学报;2002年02期

5 季庆;神经干细胞的研究近况[J];医学综述;2002年05期

6 田玲;;蛋白可促使神经干细胞移动[J];国外医学情报;2002年09期

7 张敬军,刘焯霖;神经干细胞的研究[J];中国病理生理杂志;2003年04期

8 张国福,林建华;神经干细胞的研究进展[J];福建中医药;2003年03期

9 刘岳文,杜永红,王可,徐正顺;神经干细胞的研究进展[J];河南科技大学学报(医学版);2003年02期

10 王任直;张波;窦万臣;郑彤;;神经干细胞应用的理论基础和策略[J];医学研究通讯;2003年09期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 王华;王文辉;林蕾;;神经干细胞的研究进展及前景展望[A];第六届西部介入放射学术会议宁夏医学会放射学分会第四届年会介入放射学新技术继续教育学习班论文汇编[C];2009年

2 戴毅;韩忠朝;;神经干细胞研究进展及临床前景展望[A];中国解剖学会第八届组织学与胚胎学专业青年研讨会论文集[C];2004年

3 孙一睿;胡锦;王尔松;奚才华;姚海军;;单层黏附培养技术在哺乳动物神经干细胞体外稳定增殖和多向分化中的应用[A];中国医师协会神经外科医师分会第四届全国代表大会论文汇编[C];2009年

4 刘佳梅;;脑内皮细胞与神经干细胞共培养促进神经干细胞的迁移[A];中国解剖学会第十一届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会论文汇编[C];2009年

5 魏勇;应大君;张伟;董世武;;幼龄家猪脑SVZ神经干细胞的分离与鉴定[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年

6 司银楚;朱培纯;程龙;吴海霞;许红;;去皮层血管对成年大鼠脑内神经干细胞的影响[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年

7 李学坤;郭安臣;左萍萍;;胎鼠海马神经干细胞的培养、鉴定及亚克隆[A];中国药理学会第十届全国神经学术会议暨浙江省药理学会2002年年会论文摘要集[C];2002年

8 李力;万琪;;小鼠神经干细胞培养及缺血神经元对其增殖、分化的影响[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年

9 李力;万琪;刘永红;张巍;;小鼠神经干细胞培养及缺血神经元对其增殖、分化的影响[A];科技、工程与经济社会协调发展——中国科协第五届青年学术年会论文集[C];2004年

10 徐群渊;;神经干细胞的分离、纯化和永生化[A];中国组织工程、干细胞与神经再生学术会议论文集[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 胡德荣;“抑制蛋白”可控制神经干细胞提前分化[N];健康报;2007年

2 孙国根　白毅;灵长类脑内神经干细胞被发现[N];中国医药报;2011年

3 孙国根;阻碍卒中后神经干细胞再生的“元凶”被发现[N];中国医药报;2013年

4 ;我国科学家成功地在体外培养出神经干细胞[N];中国高新技术产业导报;2001年

5 沈丽 付钰;神奇的神经干细胞[N];科技日报;2002年

6 时仲省 高思敏 刘春阳;河南医大成功培养人胚神经干细胞[N];中国医药报;2001年

7 梓华;神经干细胞可治恶性脑癌[N];医药经济报;2002年

8 许琦敏;脑损伤修复治疗又有新希望[N];文汇报;2007年

9 北京市神经外科研究所 北京天坛医院 王忠诚邋院士;神经修复的生力军——神经干细胞[N];健康报;2008年

10 孙国根;神经干细胞并非“全能制造者”[N];中国医药报;2009年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 张帆;Miranda磷酸化调控果蝇神经干细胞不对称分裂的机制[D];浙江大学;2014年

2 张坤;极化巨噬细胞与脊髓来源神经干细胞联合移植对脊髓损伤治疗作用的研究[D];第四军医大学;2015年

3 褚天慈;血管生成素2对胎鼠脑皮层神经干细胞诱导分化作用及其分子机制的研究[D];天津医科大学;2015年

4 胡园园;AF1q在神经发育中的功能及调控机制研究[D];山东大学;2015年

5 张凤云;神经干细胞中PFK-1对神经发生的负调控作用[D];南京医科大学;2016年

6 郭立云;猕猴胚胎源性神经干细胞诱导、脑内移植及其在青光眼玻璃体内的转归—探索性研究[D];昆明医科大学;2013年

7 任永娟;材料调控神经干细胞的研究[D];清华大学;2009年

8 曹翠丽;大鼠神经干细胞的体外培养及向神经元的诱导分化[D];河北医科大学;2005年

9 周虎田;骨髓源神经干细胞生物学特性的研究[D];第一军医大学;2005年

10 段发亮;神经干细胞培养、增殖、迁移和分化的研究[D];第一军医大学;2005年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 李武雄;MK-801在谷氨酸-Shh信号通路中的阻断作用[D];新乡医学院;2014年

2 冯旭;NeuroD慢病毒载体构建及在大鼠神经干细胞的过表达[D];福建医科大学;2015年

3 闫姗姗;人脐带间充质干细胞重编程为神经干细胞的调控机制研究[D];北京协和医学院;2015年

4 魏维;松果菊苷对神经干细胞体外增殖的影响[D];福建中医药大学;2015年

5 周强意;转TrkC神经干细胞联合胶原支架对创伤性脑损伤大鼠模型治疗作用的实验研究[D];北京协和医学院;2015年

6 孙爽;孕酮对Aβ_(25-35)损伤的神经干细胞增殖和分化的影响及机制研究[D];河北医科大学;2015年

7 刘磊;神经干细胞移植治疗大鼠脑梗死的实验研究[D];郑州大学;2015年

8 张涛;降钙素基因相关肽促进体外培养的神经干细胞向神经元分化[D];苏州大学;2015年

9 杨明;谷氨酸/NMDA1、Shh介导的成体NSC增殖分化信号通路的研究[D];新乡医学院;2015年

10 甘小凤;弓形虫抑制Wnt/β-catenin通路干扰C17.2神经干细胞的分化[D];安徽医科大学;2015年

本文编号：945064