单核细胞趋化蛋白1诱导蛋白调节BV-2细胞的炎症因子表达

发布时间：2017-10-04 20:00

  本文关键词：单核细胞趋化蛋白1诱导蛋白调节BV-2细胞的炎症因子表达

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【摘要】：研究背景缺血性脑卒中、缺血缺氧性脑病、神经退行性疾病如帕金森病(Parkinson's disease, PD)、多发性硬化(multiple sclerosis, MS)、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)和其他颅内炎症相关性疾病产生炎症因子和抗炎症因子,继而调节神经炎症以及疾病的病理过程。有研究报道缺血性脑卒中后可诱发外周血的中性粒细胞、单核巨噬细胞浸润以及小胶质细胞激活、释放炎症因子,加重了神经元、血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的损害,导致脑卒中后的神经组织发生二次损伤,使神经功能进一步恶化。另外,以中老年人高发病率为特点的PD、AD,是人类最常见的神经退行性疾病,严重危害着人类健康,并且此类疾病发病原因及机制复杂,目前有遗传学说、感染学说、氧化应激学说、神经毒性学说等,迄今尚未被具体阐明,所以关于此类疾病的治疗是长久以来医学研究的一个难题。随着免疫组织化学以及分子生物学的发展,发现神经退行性疾病患者的神经组织中存在着局部炎症反应,而小胶质细胞激活后所表达产生的一系列炎症因子已被证实是导致此类疾病发生、发展的重要病理机制之一。以上说明了小胶质细胞和炎症因子在颅内疾病的发病机制中起着十分重要作用。小胶质细胞是中枢神经系统(central nervous system, CNS)中主要的免疫细胞。当神经组织受到病原体、异物大分子等刺激时,小胶质细胞可迅速由静息状态转换为激活状态继而产生炎症介质介导颅内免疫反应,协助清除细胞碎片、病原体微生物、异物大分子等,对维持CNS的平衡状态具有独特的作用。但激活小胶质细胞具有双刃剑的特点,一方面小胶质细胞可通过释放炎症因子抵抗病原体及其他异物的损害；另一方面在特定的环境下,激活的小胶质细胞释放大量的一氧化氮(nitric oxide, NO)、前炎症因子如白介素(interleukin,IL)-1/6/12、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)等具有神经元毒性作用的炎症介质加重神经组织损伤。因此,针对小胶质细胞介导神经炎症的作用环节,可发现神经炎症相关性疾病有效的治疗靶点。单核细胞趋化蛋白1诱导蛋白(monocyte chemotactic protein-induced protein, MCPIP)又名ZC3H12A。基于此蛋白分子具有核酸内切酶活性,后来又将其命名为调节性RNA酶-1 (regulatory RNase-1, Regnase-1)。该蛋白由具有RNA酶活性的PIN-类似结构域、核定位序列、可结合RNA的CCCH型锌指结构域和2个介导蛋白相互作用的脯氨酸富集区组成。MCPIP是一种新发现的CCCH型锌指蛋白,目前研究已明确的CCCH型锌指蛋白如Roquin、Tristetraprolin蛋白均参与RNA的代谢,尤其是炎症因子的mRNA降解,对炎症反应具有负调节作用。由此推测,MCPIP在CNS中可能具有抑制炎症反应的特性。炎症反应是机体抵抗病原体的重要机制,分泌炎症因子抵御病原体保护机体组织,同时炎症过程也受到适当的抑制调节以防止过度的炎症反应导致机体组织损伤。而转录后调控是调节炎症反应的重要机制之一,目前已有实验研究阐明了MCPIP具有转录后调控炎症反应的生物功能,可直接降解炎症相关因子的mRNA或抑制炎症信号通路,在调控炎症反应过程中起着重要作用,MCPIP也因而成为炎症相关研究领域中备受关注的热点。MCPIP的PIN-类似结构具有RNA酶活性,可直接降解多种编码炎症因子的mRNA分子如IL-1β,IL-6, IL-12p40等。除此之外,CCCH型锌指结构域以及其上游的一个N末端保守序列(N-terminalconserved region, NCR)具有去泛素化活性,有研究表明MCPIP的去泛素化活性可抑制NF-κB和JNK信号通路,继而下调炎症因子的基因表达。因此,MCPIP是一个免疫负调节因子,可通过发挥RNA酶活性以及去泛素化活性抑制炎症反应。到目前为止关于MCPIP与神经系统相关的国内外研究很少,因此MCPIP是否对颅内炎症反应的具有调控作用尚不清楚,但近几年仍然有个别研究报道了MCPIP与CNS疾病的关系。研究发现MCPIP参与了脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)或电针预刺激诱导的大脑缺血耐受效应,并发现敲除ZC3H12A基因的大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型小鼠表现出更大的缺血面积以及更高的炎症因子表达。说明MCPIP在CNS中具有抑制颅内炎症的潜能,但仍需要更多的研究进一步阐明。MCPIP在包括T细胞、单核细胞、巨噬细胞等多种免疫细胞被多种炎症分子如LPS、IL-1β、TNF-α等诱导表达,而MCPIP又可负调节免疫细胞的生物功能,从而维持免疫稳定和炎症反应平衡。近年来有研究发现MCPIP同样在小胶质细胞中被诱导表达,但在颅内炎症过程中小胶质细胞表达的MCPIP是否负调节小胶质细胞的炎症反应尚不清楚。本研究组将以小胶质细胞株BV-2细胞为研究对象,通过实验探究LPS或糖氧剥夺／复糖复氧(oxygen-glucose deprivation plus reoxygenation, OGD/R)是否能诱导BV-2细胞表达MCPIP,并通过功能缺失的方法探讨MCPIP对BV-2细胞的炎症抑制效应；最后,探究LPS刺激下MCPIP对神经元的潜在保护效应,从而评价MCPIP对颅内炎症反应的调控作用以及对神经组织的保护作用。研究目的1.明确LPS或OGD/R干预下是否可诱导MCPIP在BV-2细胞中表达。2.在LPS刺激下,探究MCPIP被敲低后是否增加BV-2细胞炎症因子表达并加重LPS诱导BV-2细胞的神经元毒性。研究方法1.LPS刺激BV-2细胞诱导MCPIP表达小鼠小胶质细胞株BV-2细胞用DMEM培养基加10%胎牛血清Fetal Bovine Serum, FBS)培养,当BV-2细胞生长密度约80%时,用LPS(1μg/ml)在不同时间点(4,8,12及24h)分别刺激细胞。另外用不同浓度LPS(0.1,0.3及1μg/ml)分别刺激BV-2细胞4h,每组独立重复3次。最后用常规RT-PCR和Western blot方法分别检测mRNA和蛋白表达水平,明确LPS刺激下BV-2细胞表达MCPIP的变化。2.建立BV-2细胞的体外缺氧再灌注模型用BV-2细胞进行OGD/R处理,模拟体外缺血再灌注状态。将OGD与REOX不同时间点之间的组合,将BV-2细胞分成7组,OGDlh/R3h、OGDlh/R24h、 OGD2h/R3h、OGD2h/R24h、OGD4h/R3h、OGD4h/R24h及正常对照组,每组独立重复3次。用Western blot方法明确不同OGD/R时间点组合诱导BV-2细胞表达MCPIP的表达变化。3.确立siRNA转染BV-2细胞的转染时间将MCPIP特异性siRNA转染到BV-2细胞中(siMCPIP组),错义序列siRNA作为阴性对照(siControl组)。根据说明书操作说明将Lipofectamine 2000 (5 μl/ml)和siRNA(50pM)混合后加到细胞培养基中转染。实验分为2组,一组siRNA转染细胞24h,另外一组siRNA转染细胞48h,实验独立重复3次,采用常规RT-PCR及DNA凝胶电泳最后确认转染效率,摸索转染效率较好的转染时间。4.检测MCPIP敲低后BV-2细胞炎症相关因子的表达变化实验分为两组,siMCPIP组以及siControl组。转染后用相同浓度LPS(1 u g/ml)刺激BV-2细胞4h,提取总的RNA,逆转录后行荧光定量RT-PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction, QRT-PCR),特异性扩增MCPIP以及炎症因子IL-12b、IL-6、IL-1β、IL-23、即刻早期反应蛋白3(immediate early response 3,IER3)、肿瘤坏死因子受体2 (tumor necrosis factor receptor2,TNFR2)、可诱导刺激分子(inducible costimulator, ICOS)的cDNA。实验独立重复3次,相对RNA表达量用2-△△Ct方法计算。5.检测MCPIP低后BV-2细胞上清的对SH-SY5Y的神经元毒性实验分为两组,siMCPIP组及siControl组。BV-2细胞完成转染后,用LPS(0.1μg/ml)刺激细胞4h换新鲜DMEM培养基,继续培养24h并收集细胞上清。将细胞上清与神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞共孵育6h。3次独立重复实验,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)法测量SH-SY5Y细胞的细胞存活率；用乳酸脱氢酶(dehydrogenase, LDH)释放实验测量SH-SY5Y细胞的死亡率。6.统计分析本研究全部数据均采用SPSS13.0统计分析软件进行分析,两独立样本实验方差齐的数据采用Student's t检验方法,方差不齐的数据采用Wilcoxon秩和检验。统计学结果以平均值±标准差(X±S)表示,P0.05有统计学意义。结果1.常规RT-PCR以及Western blot结果表明,相同浓度的LPS(1μg/ml)分别刺激BV-2细胞4、8、12和12h,LPS刺激4h后MCPIP的mRNA表达即显著增加并持续至24h(P0.01)。与此不同的是,MCPIP的蛋白表达水平也呈现时间依赖性,从4h开始缓慢增加并在12h到达表达高峰,但在LPS刺激24h后MCPIP蛋白表达明显下降。另外,不同浓度的LPS (0.1、0.3、1μg/ml)刺激BV-2细胞均可明显诱导MCPIP表达增高(P0.05)。2.不同OGD/R时间点组合的干预下能诱导BV-2细胞MCPIP蛋白表达增加。Western blot结果表明OGD2h/R3h、OGD2h/R24h两组对BV-2细胞表达MCPIP蛋白的诱导能力较强。3.BV-2细胞转染siRNA48h(P0.05)较24h(P0.05)能得到较好的敲低效率,siRNA转染48h后QRT-PCR结果显示MCPIP的敲低效率可达约60%。LPS刺激下,对siControl组,MCPIP敲低后会导致BV-2细胞的IL-6、IL-12b的mRNA表达增加(P0.05),却显著降低了立即早期反应蛋白3(immediate earlyresponse 3, IER3)的mRNA表达(P0.05),其他的炎症因子IL-1β、IL-23、 TNFR2、ICOS的mRNA表达变化较阴性对照组无统计学意义(P0.05)。4.LPS刺激BV-2细胞后收集细胞上清,然后将细胞上清与SH-SY5Y细胞共孵育后研究发现,MCPIP敲低后BV-2细胞的细胞上清具有更大的神经元毒性。对比siControl组,MCPIP敲低后的细胞上清与SH-SY5Y细胞共孵育,SH-SY5Y细胞存活率降低(P0.05)且细胞死亡率更高(P0.05)。结论1.本研究通过体外实验验证了小胶质细胞株BV-2细胞可被LPS或OGD/R诱导表达MCPIP的表达,可为将来更进一步颅内炎症相关性疾病研究提供研究基础。2.LPS刺激下,MCPIP调节BV-2细胞中炎症因子的表达,MCPIP敲低后BV-2细胞表达IL-12b、IL-6增加而IER3表达下降,进一步证明了小胶质细胞表达的MCPIP参与调控颅内炎症反应。3.LPS刺激下,MCPIP敲低后BV-2细胞的细胞上清使SH-SY5Y细胞存活率降低、死亡率增高,说明在颅内炎症反应过程中MCPIP调节了小胶质细胞激活介导的神经元毒性作用,论证了MCPIP具有神经保护的潜在作用。
【关键词】：单核细胞趋化蛋白1诱导蛋白 小胶质细胞 神经炎症 神经保护
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-24
• 1. 颅内炎症相关性疾病18-20
• 2. 单核细胞趋化蛋白-1诱导蛋白与炎症反应20-23
• 3. 研究内容及研究目的23-24
• 材料与方法24-36
• 1. 实验材料与仪器24-26
• 2. 实验方法26-35
• 3. 统计分析35-36
• 结果36-42
• 1. LPS和OGD/R诱导BV-2细胞表达MCPIP36-39
• 2. MCPIP调节BV-2细胞中炎症因子的表达39-40
• 3. 抑制MCPIP表达导致BV-2细胞的细胞上清神经元毒性增强40-42
• 讨论42-50
• 1. 细胞模型及处理因素选择的合理性42-43
• 2. LPS和OGD/R可诱导BV-2细胞MCPIP表达43-45
• 3. MCPIP抑制小胶质细胞的炎症反应45-48
• 4. MCPIP具有保护神经元的潜在作用48-50
• 局限性与展望50-51
• 全文总结51-52
• 参考文献52-59
• 中英文缩写词对照表59-61
• 综述61-74
• 参考文献69-74
• 攻读学位期间成果74-75
• 致谢75-77

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