构建大鼠白细胞介素1β基因shRNA及过表达腺病毒载体

发布时间：2017-10-05 08:35

  本文关键词：构建大鼠白细胞介素1β基因shRNA及过表达腺病毒载体

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【摘要】：目的:神经病理性疼痛是目前麻醉工作中常见的一种难治性的慢性疼痛,其具体的发生及发展机制十分复杂,有众多的细胞因子、蛋白质等物质参与其中。研究表明,白细胞介素1β(IL-1β)是其中一种起主要作用的细胞因子,其在体内表达水平的上升是诱导产生神经病理性疼痛的重要因素。特异性下调体内IL-1β蛋白的表达水平能够有效缓解由躯体感觉神经系统受到损伤后直接导致的神经病理性疼痛。采用基因治疗领域的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术可以在基因水平下调IL-1β在体内的表达。其具体原理是通过设计并合成IL-1β特异性的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA),在转录后水平上抑制目的蛋白的表达。与si RNA相比,短发卡状RNA(short hairpin RNA,sh RNA)可以更加稳定、高效地抑制目的蛋白的表达,但是单纯的sh RNA并无法高效地进入靶细胞中发挥对目的蛋白的下调作用,因此必须借助一定的载体。而腺病毒载体的特点是可以感染大多数的细胞,并且其感染效率较高以及能够在宿主细胞中稳定表达等特点。因此,本实验中通过构建IL-1β的sh RNA腺病毒载体以及过表达腺病毒载体来观察其对目的蛋白表达水平的影响,从而进一步为麻醉工作中神经病理性疼痛的诊治提供一种有效措施。具体目的是构建大鼠IL-1β基因的sh RNA腺病毒载体以及过表达腺病毒载体并检测其对目的蛋白表达水平的影响。方法:构建IL-1β的sh RNA腺病毒载体:根据NCBI中查询获得的大鼠IL-1β基因序列设计3条si RNA并合成相应的sh RNA,分别为sh RNA1、sh RNA2、sh RNA3。将采用3’和5’单链退火得到的sh RNA基因产物和经过Bam HⅠ和Eco RⅠ双酶切的p HBAd/U6/GFP载体连接,构建IL-1βsh RNA腺病毒载体穿梭质粒。之后将得到的穿梭质粒转化大鼠感受态细胞DH5α,在培养皿中挑菌后将菌液交与上海尼桑生物技术有限公司对其中的基因序列进行测定。测序完成后将穿梭质粒与骨架质粒(p HBAd/BHG)共转染HEK(人胚肾)293细胞,进行IL-1β基因的sh RNA腺病毒载体(r Ad/sh RNAs)的包装与扩增,所得产物分别为r Ad/sh RNA1、r Ad/sh RNA2、r Ad/sh RNA3。将r Ad/sh RNAs感染培养好的大鼠H9C2细胞,使用荧光显微镜观察其对细胞的感染效率,然后采用Western Blot测定r Ad/sh RNAs对目的蛋白表达水平的影响。构建IL-1β的过表达腺病毒载体:通过NCBI查询得到大鼠IL-1β的基因序列,设计引物并使用PCR技术扩增其CDS(Coding sequence)区。取p HBAd/MCMV/RFP干扰载体,与得到的基因片段均采用Eco RI和Not I双酶切处理。酶切之后,将扩增的基因片段与干扰载体相连接,构建大鼠IL-1β的过表达腺病毒载体穿梭质粒。之后将构建完成的穿梭质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,在培养皿中挑菌后将产物交与上海尼桑生物技术有限公司对其中的基因序列进行测定。序列测定完成后将构建好的穿梭质粒与骨架质粒(p HBAd/BHG)共转染HEK293细胞,进行IL-1β过表达腺病毒载体(r Ad/IL-1β)的包装与扩增。最后将构建完成的r Ad/IL-1β感染培养好的大鼠H9C2细胞,使用荧光显微镜观察其对宿主细胞的感染效率,采用Western Blot验证IL-1β的过表达。结果:测序结果显示IL-1β基因的3条sh RNA腺病毒载体穿梭质粒中的序列分别与所设计的3条sh RNA序列相同;过表达腺病毒载体穿梭质粒中的序列与NCBI中查询获得的大鼠IL-1β的基因序列相同。成功构建了大鼠IL-1β基因的sh RNA腺病毒载体(r Ad/sh RNA1、r Ad/sh RNA2、r Ad/sh RNA3)和过表达腺病毒载体(r Ad/IL-1β)。r Ad/sh RNA1、r Ad/sh RNA2、r Ad/sh RNA3均可以下调IL-1β蛋白的表达,其中r Ad/sh RNA2的下调效果最明显,而r Ad/IL-1β则可以明显上调IL-1β蛋白的表达。结论:大鼠白细胞介素1β基因的sh RNA腺病毒载体的应用为临床麻醉工作中对于神经病理性疼痛的治疗提供了一种新的思路,表明了基因治疗技术在疼痛治疗领域中也具有广阔的应用前景。
【关键词】：神经病理性疼痛 白细胞介素1β RNA干扰 短发卡RNA 腺病毒载体
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 常用缩写词中英文对照表11-12
• 前言12-14
• 1 材料与方法14-25
• 1.1 主要实验材料14-17
• 1.2 常用缓冲液的配制方法17-18
• 1.3 实验方法18-23
• 1.4 主要观察指标23-24
• 1.5 统计学分析24-25
• 2 结果25-30
• 2.1 IL-1β 的shRNA及过表达腺病毒载体穿梭质粒的构建25
• 2.2 腺病毒载体感染效率的鉴定25-27
• 2.3 Western Blot检测rAd/shRNAs对IL-1β 表达水平的影响27-29
• 2.4 Western Blot检测r Ad/IL-1β 对目的蛋白表达水平的影响29-30
• 3 讨论30-33
• 4 结论33-34
• 参考文献34-38
• 综述38-49
• 参考文献44-49
• 致谢49-50
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果50-51
• 个人简历51

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 陈杰;;外周血IL-1β和IL-6水平与腰椎间盘突出症腰腿痛疼痛程度的临床研究[J];实用预防医学;2012年12期

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本文编号：975815