P物质对BMSCs源性内皮与成骨细胞体外联合培养体系的作用效果观察

发布时间：2017-10-09 23:00

  本文关键词：P物质对BMSCs源性内皮与成骨细胞体外联合培养体系的作用效果观察

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【摘要】：各种原因造成的临床大段骨缺损以及骨不连的修复问题，都是骨科学术界一直以来研究的热点以及难点。目前临床上通常采用的处理办法包括自体骨移植和异体骨移植，然而其相关技术均不同程度地存在一些不足，故而无法达到临床的实际应用需求。随着骨组织工程领域不断深入的研究，其为临床骨缺损的修复提供了新的思路和方法。组织工程骨材料复合种子细胞以及神经因子应用于大段骨缺损修复，具有良好的可塑性以及成骨效应，临床应用备受期待。 骨折愈合是一个复杂的生理过程，涉及多种细胞和细胞因子之间的协同作用。生长因子作为人体组织和器官发生、发育以及成熟的重要物质，为骨缺损修复提供最基本的营养基础，而神经递质对骨代谢的影响作用尤为突出。P物质（substance P，SP）是最早发现的神经肽递质，已经证实SP神经肽来源于感觉神经纤维，可作用于成骨细胞，且贯穿于骨折愈合的整个过程。然而目前的实验研究存在分歧，SP对骨代谢成骨细胞的作用效果尚不明确。据文献报道证实，成骨细胞与血管内皮细胞体外联合共培养体系，可促进成骨细胞的增殖以及组织工程骨的血管化再生进程，有助于增强组织工程骨对骨缺损的修复。因此，本实验通过建立骨髓基质干细胞（BMSCs）源性内皮细胞（ECs）与成骨细胞（OB）体外联合培养体系，观察SP对此共培养细胞体系的最适浓度以及作用效果，明确SP对内皮与成骨细胞共培养体系功能的影响，探索SP在骨缺损修复中的应用前景。 目的： 观察P物质(substance P，SP)在骨髓基质干细胞（BMSCs）源性内皮细胞（ECs）与成骨细胞（OB）体外联合培养体系中的最适浓度；以及其对BMSCs源性内皮与成骨细胞体外联合培养的作用，为应用SP促进组织工程骨修复骨缺损提供实验支持。 方法： 第一部分：P物质在BMSCs源性内皮与成骨细胞体外联合培养体系中的最适浓度 采用新生新西兰大白兔胎兔（雌雄不限）密度梯度离心法分离骨髓基质干细胞行体外培养和连续传代,获得较纯的BMSCs。连续传代后第3代BMSCs进行分化诱导内皮细胞以及成骨细胞，并进行细胞相关定性检测鉴定。两种细胞诱导7d后，将其按照1：2比例直接混合培养，待细胞传至第2代后，加入1×10-12-1×10-6mol/L不同浓度的SP作为实验组，以正常未加SP的细胞培养基为对照组。培养后1、3、5、7d采用CCK-8法测定细胞增殖活性，并用sigma-plot软件生成生长曲线，观察细胞生长数量，测定碱性磷酸酶活性及骨钙素表达量。 第二部分：P物质对BMSCs源性内皮与成骨细胞体外联合培养体系的作用效果观察 分别建立BMSCs源性内皮细胞(ECs)与成骨细胞（OB）单独培养，或按1:2的比例体外直接或间接共培养体系，细胞内同时加入1×10-8mol/L SP。培养48小时后采用流式细胞周期分析细胞增殖与活性，并分别采用酶联免疫法（ELISA）检测碱性磷酸酶（ALP）的表达，实时定量PCR（rt-PCR）检测骨钙素（OC）mRNA基因的表达。以不添加SP的细胞培养体系作为对照组，比较加入SP时各组细胞功能的变化。 结果： 第一部分 CCK-8曲线图可以直观的看出1d时除低浓度组1×10-12mol/L作用效果不明显外，其余SP浓度组作用效果明显；3d以后SP各浓度组对共培养细胞均具有促进作用且随着时间的推移作用效果呈现增长，而SP浓度组1×10-8mol/L时细胞的促进增殖效果最明显，组间比较效果显著，细胞增生活跃。碱性磷酸酶ALP活性表达结果提示3d以后SP作用效果明显，低浓度组1×10-12mol/L作用效果不明显，而1×10-8-1×10-6mol/L作用效果明显。骨钙素（BGP）的表达检测中3d以后各浓度SP实验组较空白对照均有所提高，而在1×10-8mol/L的SP浓度组作用效果最明显，且在1×10-8mol/L浓度组相较于其他SP实验组也具有显著性差异。 第二部分： 较OB单独培养，间接共培养时流式细胞周期检测表现为G1期明显减少，S期阻滞（P0.05）；ALP的表达有所提高（P0.05）；OC mRNA的表达则显著性升高（P0.001）。较OB单独培养，直接共培养时ALP和OC mRNA的表达均显著性升高（P0.001）。在促进ALP和OC mRNA的表达上，直接共培养较间接共培养均有所提高（P0.05）。加入SP后,实验组OB单独培养相较对照组OB单独培养,流式细胞周期检测显示细胞阻滞于G2/M期，，G1期明显减少（P0.05）；ALP活性有所升高，OC的mRNA的表达水平也有所提高（P0.05）。实验组共培养细胞较对照组共培养细胞,流式细胞周期检测显示G1期明显减少（P0.001），细胞阻滞于G2/M及S期；ALP的表达有所上升，OC的mRNA的表达水平有所提高（P0.05）。 结论： 在体外内皮与成骨细胞联合共培养中,SP对新种子细胞促进效果明显，其在1×10-8mol/L对联合共培养的成骨细胞增殖和活性作用最强。BMSCs源性内皮细胞与成骨细胞共培养体系细胞相容性良好，SP可促进OB的活性,并且可显著促进共培养体系中OB的增殖与活性。
【关键词】：P物质 BMSCs 成骨细胞 内皮细胞 共培养
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-15
• 文献回顾15-22
• 一、SP 分子生物学特性15-16
• 二、SP 受体16-19
• 三、SP 在骨代谢中的作用19-22
• 第一部分 P 物质在 BMSCS 源性内皮与成骨细胞体外联合培养体系中的最适浓度.1922-38
• 1 实验材料22-24
• 2 实验方法24-29
• 3 实验结果29-34
• 4 讨论34-38
• 第二部分 P物质对BMSCS源性内皮与成骨细胞体外联合培养体系的作用效果观察38-49
• 1 实验材料38-40
• 2 实验方法40-42
• 3 实验结果42-46
• 4 讨论46-49
• 小结49-50
• 参考文献50-61
• 个人简历和研究成果61-62
• 致谢62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：1002886