蓝白斑筛选技术的改进及其生物医学应用

发布时间：2017-10-24 16:01

  本文关键词：蓝白斑筛选技术的改进及其生物医学应用

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【摘要】：目的：探讨蓝白斑筛选技术在生物医学方面的新应用：（1）TALENs（transcription activator-like effector nucleases）活性检测和脱靶效应评估；（2）检测EGFR基因外显子19碱基缺失突变新方法。 方法：设计合成一系列片段长度小于150bp的插入片段，将插入片段与两种T/A克隆载体（pGEM-T Easy vector和pTrueBlue vector，具有不同的插入位点，分别位于密码子7和另一个是密码子11和36之间）连接，，进行分子克隆，进一步观察菌落颜色并通过测序验证；人工构建基于蓝白斑筛选的含有TALENs靶序列的报告质粒，进一步提出一种原核水平检测TALENs有效性方法的可能性；设计一组特异性PCR引物，以样本DNA（如人工构建的EGFR野生型、突变型质粒、肿瘤组织DNA、血中游离DNA等）为模板进行PCR，进一步进行分子克隆。结合蓝白斑筛选，人为改变阅读框架，致使野生型阅读框架中含有终止密码子TAA，缺失突变型因丢失一段核酸片段而不含有终止密码子TAA，从而通过观察菌落的颜色来确定样品有无EGFR基因外显子19的碱基缺失突变。 结论：基于两种不同插入位点的TA克隆载体（pGEM-T Easy vector和pTrueBlue vector），若插入片段若是3的整数倍则菌落呈蓝色；若是3的非整数倍则菌落呈白色。因此，理论上插入或缺失突变若导致LacZ阅读框移码则呈现菌落蓝色变为白色的现象。成功构建2种含有TALENs靶序列的报告质粒，2种质粒的LacZ阅读框分别为移码与非移码，对应菌落颜色为白色、蓝色；在此基础上提出一种检测TALENs有效性的方法，即当TALENs特异性剪切蓝白斑筛选载体上的靶序列时，导致多肽阅读框的非移码与移码变换，从而共转化后菌落颜色改变。该体系还可广泛应用于锌指蛋白核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs），CRISPR-cas系统（CRISPR Cas systems）有效性检测。分别以人工构建的EGFR野生型、突变型质粒、肺癌肿瘤组织基因组DNA为模板进行PCR、分子克隆，结果显示野生型插入片段分子克隆的菌落为白色，突变型插入片段分子克隆的菌落为蓝色。
【关键词】：蓝白斑筛选 TAcloning 反因子蛋白酶（TALENs） EGFR基因
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-8
• 研究背景8-10
• 第一部分 探究TrueBlue技术，发现新规律10-21
• 材料和方法10-15
• 结果15-19
• 讨论19-21
• 第二部分 蓝白斑筛选技术生物应用（1）---TALENs活性检测和脱靶效应评估技术21-30
• 前言21-24
• 材料与方法24-26
• 结果26-27
• 讨论27-30
• 第三部分 蓝白斑筛选技术生物应用（2）---检测EGFR基因外显子19的碱基缺失突变新方法30-40
• 前言30-31
• 材料与方法31-35
• 结果35-38
• 讨论38-40
• 结论40-41
• 参考文献41-43
• 综述43-64
• Reference58-64
• 攻读硕士学位期间发表的文章64-65
• 中英文缩略词表65-66
• 致谢66-67

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本文编号：1089460